新生儿血液中氨基酸和酰基肉碱检测方案(液质联用仪)

应用简报： LC-MS/MS进行新生儿遗传代谢疾病的应用研究 应用中心 前言 新生儿疾病筛查是指在新生儿期对某些危害严重的先天性疾病、遗传性出生缺陷病进行群体普查和早期诊治，提高出生人口健康素质的专项保健技术。 氨基酸和酰基肉碱类化合物的同时测定可以提供超过30个代谢异常的相关信息，如：苯丙酮酸尿症(PKU)和长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)。 传统的分析方法如时间分辨荧光免疫法、酶免疫分析法等一次实验仅能检测一项疾病，不利于大规模样品的高效分析；基于流动动射的LC-MS/MS方法在2分钟内对一个标本进行几十种代谢产物分析，一次实验能够提供30余种疾病信息， 具有高灵敏度、高特异性、高选择性和快速性等质谱条件：优点。 本文应用非衍生化样本处理的液相色谱串联质谱技术对新生儿足跟血干血斑中的氨基酸和酰基肉碱进行检测，以便于于新生儿遗传代谢疾病的筛查。 实验部分 标准品和试剂：试剂：新生儿筛查检测试剂盒 仪器： ULC 510超高效液相色谱仪(具体配有二元超高压输液泵、超高压自动进样器(含冷却功能)、柱温箱)、EXPEC 5210三重四极杆串联质谱仪。 液相色谱条件： 流动相：新生儿筛查试剂盒流动相； 初始流速： 0.2mL/min； 进样量：10pl； 洗脱方式：采用梯度洗脱，时间程序见表1。 表1梯度洗脱条件 表2各化合物监测离子对及参数 序号 化合物名称 母离子 子离子 碰撞能量 (V) 1 Gly 76 30 12 2 Gly-IS 78 32 12 3 Ala 90 44 12 4 Ala-IS 94 48 12 5 Val 118 72 13 6 Val-IS 126 80 13 7 Leu 132 86 13 8 Leu-IS 135 89 13 Met 150 104 14 10 Met-IS 153 107 14 11 Phe 166.1 120 18 12 Phe-IS 172.1 126 Arg 175.1 Arg-IS 180.1 30 15 Cit 176.1 159 13 接上表2 精密度 应用简报： 编号： LC-MSMS 2019-003 取试剂盒内提供的高、低2个浓度水平的质控品，每次各测定6次，连续测定3天。得出精密度结果，结果显示：氨基酸低值的精密度范围为0.95-5.70%；酰基肉碱低值的精密度范围为0.75-4.97%，氨基酸高值的精密度范围为1.2-5.01%；酰基肉碱高值的精密度范围为1.33-4.70%。 准确度 采用低浓度和高浓度两个水平的干血点质控样本进行方法验证。每个浓度的质控样品平行处理6次，对其中的氨基酸和肉碱进行分析，计算检测值和靶值的相对误差和判断检测值是否在靶值标准偏差范围内。结果表明：低浓度质控样本中氨基酸的检测值和靶值的相对误差的绝对值范围为0.31-6.81%，高浓度质控样本中氨基酸的检测值和靶值的相对误差的绝对值范围为0.99-14.88%；低浓度质控样本中酰基肉碱的检测值和靶值的相对误差的绝对值范围为0.42-13.76%，高浓度质控样本中酰基肉碱的检测值和靶值的相对误差的绝对值范围为0.28-22.00%；所有检测结果均在靶值目标范围内。详细结果见表3。 结果与讨论 图1低浓度质控样的典型色谱图 本文通过干血点样本简单提取，直接进样测试，采用Expec 5210测定新生儿血液中氨基酸和酰基肉碱的含量。经过精密度和准确度的考察，证明该方法可以准确、快速、稳定的进行氨基酸和酰基肉碱的含量检测，能够应用于液质法遗传代谢疾病的筛查。 应用简报：编号： 表3质控样本检测准确度评价 LC-MSMS 2019-003 目标物 低水平靶值测定均值相对误差 靶值范围 高水平靶测定均值 相对误差 靶值范围 (uM) (uM) (uM) CV(%) (uM) 值(uM) (uM) CV(%) Gly 679.43 668.99 -1.54 475.60-883.26 1638.1 1694.26 3.43 1146.67-2129.53 Ala 316.55 305.38 -3.53 221.59-411.52 796.14 830.74 4.35 557.30-1034.98 Val 268.55 265.97 -0.96 187.98-349.11 624.32 648.93 3.94 437.03-811.62 Orn 165.35 154.72 -6.43 115.75-214.96 426.09 469.34 10.15 298.26-553.91 Arg 54.25 52.55 -3.13 37.97-70.52 121.09 123.82 2.25 84.76-157.41 Leu 286.95 291.47 1.58 200.87-373.04 656.88 650.38 -0.99 459.82-853.94 Met 20.32 19.22 -5.43 14.23-26.42 80.54 83.97 4.26 56.38-104.70 Phe 59.84 61.45 2.70 41.89-77.79 391.17 385.30 -1.50 273.82-508.52 81.61 80.29 -1.62 57.12-106.09 358.9 361.45 0.71 251.23-466.57 116.84 118.47 1.40 81.79-151.90 381.75 377.94 -1.00 267.23-496.28 Pro 194.7 188.50 -3.18 136.29-253.10 680.86 715.43 5.08 476.60-885.12 Glu 257.66 256.85 -0.31 180.36-334.95 852.77 868.79 1.88 596.94-1108.60 His 71 69.22 -2.51 49.70-92.30 499.67 525.60 5.19 349.77-649.57 Ser 32.51 30.91 -4.91 22.75-42.26 215.98 248.11 14.88 151.19-280.77 Thr 21.09 20.58 -2.42 14.77-27.42 105.08 112.59 7.15 73.56-136.61 Trp 55.25 59.01 6.81 38.67-71.82 186.83 175.99 -5.80 130.78-242.88 Pip 167.58 172.31 2.82 117.31-217.86 1164.34 1147.66 -1.43 815.04-1513.64 C0 42.43 44.41 4.67 29.70-55.16 203.08 199.58 -1.72 142.15-264.00 C2 6.18 5.33 -13.76 4.33-8.04 34.15 41.66 22.00 23.91-44.40 C3 0.7 0.66 -5.14 0.49-0.91 3.9 4.18 7.31 2.73-5.07 C4OH/C3DC 0.23 0.20 -11.58 0.16-0.30 1.22 1.42 16.63 0.85-1.59 C4 0.67 0.64 -4.62 0.47-0.87 3.72 3.92 5.47 2.60-4.84 C50H/C4DC 0.66 0.62 -6.26 0.46-0.86 5.27 5.60 6.33 3.69-6.85 C5 0.51 0.51 -0.58 0.36-0.67 3.12 3.23 3.45 2.19-4.06 C5DC/C6OH 0.59 0.53 -9.92 0.41-0.76 2.94 3.26 10.92 2.06-3.83 C6 0.86 0.92 7.48 0.60-1.12 4.09 3.91 -4.41 2.86-5.32 C6DC 0.22 0.21 -4.03 0.16-0.29 0.78 0.80 2.20 0.54-1.01 C8 0.41 EXPEC TECHNOLOGY 本方案应用非衍生化样本处理的液相色谱串联 质谱技术对新生儿足跟血干血斑中的氨基酸和酰 基肉碱进行检测，以便于于新生儿遗传代谢疾病 的筛查。