呼吸气中挥发性物质进行可靠、灵敏和选择性检测方案(工作站及软件)

thermoscientific 呼吸活检：热脱附-气相色谱-高分辨质谱联用在非靶向呼吸气分析中的应用 Jasper Boschmans'， Cristian Cojocariu?， Paul Silcock?， Billy Boyle， Alexander Makarov3， Max Allsworthi 1Owlstone Medical Ltd.， CB4 0GA UK， 2Thermo Fisher Scientific， WA7 1TA UK， 3Thermo Fisher Scientific GmbH，Hanna-Kunath-Str. 11， 28199 Bremen 本研究的目的是采用一种新的分析方法，对非靶向代谢组学研究中，呼吸气的挥发性物质进行可靠、灵敏和选择性的分析。 通过ReCIVA呼吸气采样器，在吸附管中收集并浓缩呼吸气样本。使用与热脱附(TD)自动进样器连接的 Thermo ScientificTM Exacti-veTM GC OrbitrapTM GC-MS 系统分析样品。 Orbitrap 质谱仪的宽动态范围(>5个数量级)和 ppt 级的灵敏度可以在一次分析中同时检测高丰度挥发性有机化合物(VOC；例如丙酮)和痕量待测物，无需额外的样品制备、多次采集或稀释步骤。 采用高分辨率，高质量精度的数据，结合软件分析及其他电离方法的数据，可进一步确证呼吸气数据中 VOC 的定性结果。 本研究首次使用热脱附-GC Orbitrap/MS 平台用于预浓缩呼吸样品的分析，该系统是代谢组学研究和生物标志物发现的强有力工具。 介绍 呼出气包含多种 VOC(代谢活性产物与一系列疾病相关的生物标志物)，呼吸气检测成为非侵入性代谢组学研究中迅速应用的技术。呼出气体中 VOC 的研究由于样品基质的复杂性和呼出气体中VOC的宽浓度范围而具有挑战性。可靠地鉴定和定量痕量化合物的能力，对于非靶向研究微小代谢变化影响大量生物学相关 VOC至关重要。 过去，飞行时间质谱(TOF)一直是研究探索中较常使用的高分辨质谱仪，因其非扫描检测模式(即：完整离子包的平行检测)可在较宽的质量范围内提供不错的灵敏度，高分辨率数据又可实现化合物的精确鉴定。但是，由于 TOF 使用 MCP检测器，经常会在较高浓度下观察到离子饱和，这可能导致定量和定性的不准确。高分辨率、精确质量数(HRAM)的质量分析器(例如： Orbitrap/MS) 通过创新技术(例如： C-Trap 的自动增益控制(AGC))以亚 ppm级质量精度和高动态范围解决了其中一些分析难题。GC-Orbitrap/MS 配备可变电子电压技术(VeV)电子轰击离子源(EI)和易于更换的正/负化学电离源(CI)，因此具有可扩展的化合物定性功能。 呼吸气采集 成功的呼吸气测量需要高度可重复的采样和分析技术。呼吸活检方案包括 ReCIVA 呼吸气采样器(图1)，该呼吸采样器是与呼吸医学领域的专家合作设计的，旨在提供一种标准化的方法来收集呼吸气样本。 通过内置的快速响应的 CO2 和压力传感器， ReCIVA 可以实时监控患者的呼吸频率，从而可以追踪患者呼出的特定呼出气组分(例如：肺泡气)。还可以使用软件在必要的时候打开/关闭采样泵，用来收集所需的部分。在呼吸气吸附管上收集选定体积和部位的呼出气体，以供后续的VOC 分析。单次采样可以收集重复的呼吸气样本和/或不同呼吸气组分的样本。 图 1. ReCIVA 呼吸气采样器(左图和中间图)实现了可靠、可重复的呼出气 VOC 的收集和预浓缩，从而提高了分析灵敏度。ReCIVA 中的压力和CO2传感器可以允许实时监控患者呼吸频率，如果需要，可以在一次收集中对不同的呼吸气组分进行采样(右图)。 方法样品 使用 ReCIVA 呼吸气采样器收集呼吸样品(吸附管1500mL)，该采样器可将 VOC 捕获并预浓缩到呼吸气吸附管上(均为 Owlstone Me-dica 有限公司)。 质控样品由溶于甲醇的40种混合物组成(中值浓度为 1100和200 ppm)。 图2.本研究中使用的 Exactive GC Orbitrap 分析仪的内部构造(左图)和TD-GC-Orbitrap仪器(右图) 数据采集 数据处理 将样品进行行吹扫以除去多余的水份，使用TD100-xr热脱附自动进样器(MarkesInternational)解吸，并使用不分流进样转移到30mx0.32 mm x3.00 um 色谱柱(Quadrex)上。通过 Thermo Scienti-ficTM TRACETM 1310 GC 柱温箱的程序升温进行色谱分离。 使用 Xcalibur 4.0 和 TraceFinder 4.1(均为 Thermo Fisher Scien-tic)进行数据处理、定性和定量分析。TraceFinder 软件通过自动解卷积生成“干净”的质谱图，然后通过谱库搜索(自建高分辨谱库和商业谱库)进行化合物鉴定。 使用具有可变电离能 El 和CI 功能的 Exactive GC Orbitrap 质谱仪(Thermo Fisher Scientific ) 获取质谱数据。分析平台如图2所示，实验参数的详细信息如表1所示。 表 1. TD100-xr 热脱附自动进样器、TRACE GC 柱温箱和 ExactiveGC Orbitrap HRAM 分析仪的实验参数 TD 参数名称 TD 参数值 预吹扫时间 (min) 0.1 在线捕集(是/否) 是 预吹扫捕集阱流速(mL/min) 50 解吸时间(min) 10.0 解吸流速(mL/min) 50 解吸温度(℃) 210 捕集解吸时间(min) 3.0 捕集吹扫流速(mL/min) 50 阱高温(℃) 250 运行模式 恒流 载气 氦气；3.00 mL/min 梯度升温(℃) 40-250 MS参数名称 MS参数值 传输线温度(℃) 250 电离模式 EI， PCI(甲烷) 离子源温度(C) 280 (EI)， 180 (PCI) 电子能量(eV) 35，70 C-Trap 电压(V) 0，2 采集模式 全扫描 质量范围(m/z) 35-350 质量分辨率(m/z 200 时的 FWHM) 60，000 207.03235；218.05114； 质量锁定内标离子(m/Z) 355.06994 结果 质量精度和离子比率 在代谢组学研究中，要在复杂的呼吸气基质中检测低浓度的分析物，因此收集 HRAM 数据对代谢组学研究至关重要。图3展示了色谱峰上每一个采集点都低于 1 ppm 的质量偏差的数据。这极大地提高了峰解卷积效果，并有助于区分目标化合物和基质离子。 Orbitrap 质量分析器的高线性动态范围确保了即使在高样品浓度下也能保持稳定的离子比率，这对于获得良好的解卷积结果、化合物定性结果和自建谱库有重要意义。 图3.44次峰扫描(100 ppm样品；左图)实现了低于 1 ppm 的质量偏差。即使在高浓度下(200 ppm样品；右图)，也能观察到稳定的离子比率。 呼吸气数据的峰解卷积会生成一个特征列表，通常包含>1000 个峰，这些峰可能是与呼吸气体相关的化学物质的真实色谱峰，也可能是假阳性结果(即：噪音)。减少假阳性峰的数量并精简峰列表对于生成可用于非靶向代谢组学的高质量数据集至关重要。结合典型的谱库匹配结果(例如：参照 NIST 谱图； SI 值)， TraceFinder可从高精度El数据计算高分辨过滤分值(即： HRF Score)，从而可以更精确地鉴定化合物。 另外，通过使用如：正构烷烃的保留时间计算的保留指数(RI)，与标准谱库中的保留指数对比，会产生一个额外的分值(即：^RI)，该分值可用于判别质谱图高度相似的化合物，提高对未知物的鉴定可信度。 真实色谱峰解卷积，可得到谱库匹配的高分值和精确的化合物鉴定结果 假峰去卷积，导致分值较低 图4.TraceFinder数据处理工作流程，例如：从原始数据中通过解卷积处理，突出显示有效色谱峰，使用各种分值(例如HRF)进行数据过滤以及使用谱库匹配进行化合物鉴定。 离子化和碎片 GC-MS分析中，在El条件下的特征碎片质谱图通常足以鉴定未知物。但是对于具有相似或相同碎片的非常类似的分析物，El数据通常不足以导致结论性的鉴定。因此，可以探索其他电离方法，如使用正/负CI，用来帮助鉴定未知物。化学电离会导致形成更高的分子离子峰 m/z(例如： [M+H*])。这可以帮助更好地区分特定类别的化合物(如：烷烃和萜烯)。 通过使用 VeV 技术电离或可变 C-Trap 电压可以获得更多补充数据信息。使用这些方法，可以获得类似El 源的碎片质谱信息，但能够观察到更高的分子离子峰[M.+]丰度。 thermoscientific 图5.不同电离技术辅助正十四烷鉴定的比较。完整的质谱图(上图)和窄m/z范围(下图)。 吸烟相关的生物标志物 通过对吸烟者与非吸烟者进行研究，比较多个受试者的呼吸样本，对 TD-GC-Orbitrap 平台的性能进行了测试。根据吸烟行为将样本分为三类：从不吸烟者(n=3)、吸烟者(n=4)和开烟者(n=5)。使用上述工具为每个样本生成可靠的峰列表。基于先前在文献中报道的与吸烟相关的呼吸气标志物，自定义创建了6种化合物的数据库，并将其用于每个呼吸气样品中这些标志物的定量。使用提取离子的峰面积响应值计算每个标志物和样品相对于非吸烟组的倍数变化。 图6显示了所有三组中大多数吸烟行为标志物的低倍变化(蓝色和白色)，表明吸烟行为与报告的标志物(例如乙苯箱形图)之间的相关性较低。在吸烟人群中，观察到2，5-二甲基呋喃和甲苯的高倍变化(红色)，这表明这两个标志物与吸烟行为高度相关性(例如：2，5-二甲基南喃箱形图)。对于该标志物观察到的较大变化是由于当前吸烟者组中存在一个异常值。 结论 ·高质量精度，常规的60000分辨率和动态范围，可改善峰解卷积、化合物鉴定和定量结果。 ( 保留指数和高分辨率过滤分值可用于整理峰列表并生成高质量的数据集。 ) ( 低/高能量下的可变 El 与化学电离一起可用于进一步了解 VOC的化学结构，尤其适用于研究具有相似El 质谱图的化合物。 ) ( 呼吸气数据显示两个吸烟相关标志物的高倍数变化，表明这些标志物与研究对象的吸烟习惯之间存在高度相关性。 ) ( 1 . 1 . N. W. K wiecien et al. H igh-Resolution Filtering for ImprovedSmall Molecule Identification via GC-MS. Anal. Chem. 2015，87， 8328-8335 ) ( 2. S. Capone et al. Chromatographic a nalysis of VOC p atterns inexhaled breath from smokers and n onsmokers. Biomed. C h ro-matogr. 2018， 32(4)，1-11 ) ( 3. S. M. Gordon et al. Volatile Organic Compounds as Breath Bio-markers f or Active and Passive Smoking. E nviron. Health Per-spect. 2002， 110(7)，689-698 ) ( 4. M. Castellanos et al. 2，5-dimethylfuran as validated bi o marker ofsmoking s t atus. N icotine T ob. Res. 2018， Ep ub a h ead of print. ) 化合物 不吸烟 不吸烟 不吸烟 吸烟者 吸烟者 吸烟者 吸烟者 戒烟者 戒烟者 戒烟者 戒烟者 戒烟者 者 者 者 苯 0.96 1.59 0.45 4.21 2.40 1.99 0.32 0.30 0.67 0.76 0.54 0.71 赛默飞 官方微信 S CIENTIFIC SCIENTIFIC 热线话ww.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎ Thermo Fisher Scientific Inc.保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 • 高质量精度，常规的 60000 分辨率和动态范围，可改善峰解卷 积、化合物鉴定和定量结果。 • 保留指数和高分辨率过滤分值可用于整理峰列表并生成高质量 的数据集。• 低/高能量下的可变 EI 与化学电离一起可用于进一步了解 VOC  的化学结构，尤其适用于研究具有相似 EI 质谱图的化合物。 • 呼吸气数据显示两个吸烟相关标志物的高倍数变化，表明这些 标志物与研究对象的吸烟习惯之间存在高度相关性。