血清样品中抗真菌药物检测方案(液质联用仪)

thermoscientific技术文献 65410 实验 热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.comSCIENTIFIC 作者 Greta Ren， Nicholas Manicke，Cornelia Boeser?. Neloni R. Wijeratne Indiana University- PurdueUniversity Indianapolis，Indianapolis， IN Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA 关键词抗真菌药物、PS-MS/MS、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、TSQAltis、VeriSpray、TraceFinder、临床研究 。应用简单、无需进行样品制备、分析快速●三种抗真菌药物使用一个定量方法 目的 使用搭载 Thermo ScientificM VeriSpray'M PaperSpray 离子源的 ThermoScientific TSQ Altis 质谱仪，开发可靠且可重复的 PaperSpray 质谱工作流程，用于临床研究上血清中抗真菌药物的定量分析。 简介 伏立康唑，伊曲康唑和泊沙康唑(图1)是用于治疗严重侵袭性真菌感染的药物。侵袭性真菌感染在免疫防御严重受损的个体中非常普遍，包括在器官或骨髓移植后接受免疫抑制药物治疗的个体，或接受癌症治疗化疗的个体。在儿科人群中使用抗真菌药物尤其具有挑战性，因其个体间和不同年龄段的药代动力学变化很大。在临床研究中，根据快速准确的药物监测结果调整剂量有助于控制感染。 N PaperSpray 质谱仪，于2010年首次描述1，是一种快速的，直接在纸上或其他多孔基质上检测生物液体斑点的方法。 在PaperSpray技术中，一种或多种分析物的提取和电离发生在含有样品的多孔基质中。文献中的一些报道已经证明了直接对生物体液?中的小分子(包括治疗药物和非法药物)进行定量分析。 PaperSpray MS 在无需样品制备和较短的周转时间内仍然保持着良好定量表现和灵敏度，引起了人们的极大兴趣。 在本研究中，我们介绍了在 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪上采用 VeriSpray PaperSpray 离子源对三种抗真菌药物(泊沙康唑，伊曲康唑和伏立康唑)进行定量的方法。VeriSpray 系统具有稳定，快速及自动化的 PaperSpray分析性能。样品存储，提取和电离都在 VeriSpray 样品板上进行，样品板上有24个独立的纸喷嘴，每一个都能单独分析一个样品(图2A)。通过 VeriSpray离子源(图2B)在几分钟内直接从干燥的生物液体斑点自动进行样品板分析。 图2. (A) VeriSpray 样品板和(B)装有 VeriSpray PaperSpray 系统的 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪 样品制备 制备混合人体血清的校准曲线范围为0.1一10 ug/mL。于分析当天加入血清，通过甲醇连续稀释制备20倍浓度的工作溶液。将血清样品与含有同位素标记的伏立康唑和伊曲康唑的内标溶液混合。泊沙康唑类没有合适的同位素标记物；采用同位素标记的伊曲康唑作为其内标。然后将血清样品(4pL)点在 Thermo Scientific MVeriSprayM卡板上，并在室温下干燥30分钟。 PaperSpray 和MS条件 使用VeriSpray系统，，进行 PaperSpray 离子化。PaperSpray 溶剂(样品再润湿及喷雾溶剂)均为乙腈/丙酮/水85/10/5，含0.01%乙酸，根据表1进行设置。采用 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪进行分析。实验条件优化喷雾电压为4.2kV，循环时间 0.8s， Q1和Q3分辨率均为0.7 Da FWHM。表2和表3中分别列有离子源参数和所有待测物的关键 MS 性能 SRM 参数。为通过注入质谱仪单个标准品被检测到的子离子设置最佳RF 透镜信息和碰撞能量。 数据采集和分析 使用 Thermo ScientificM TraceFinder TM软件4.1进行数据采集和处理。通过公式 3* Sb/m 计算检测限，其中Sb 是截距的标准误差，m 是校准线的斜率。 表 1. VeriSpray 溶剂应用参数。每次再润湿溶剂量为 10 pL。 11 12 1 1 13 Solvent dispense delay Dispense Delay (s) 1 1 1 3 3 5 5 5 5 7 7 7 7 7 表2.(A) MS条件 lon Source Parameter Value Spray Voltage Time Dependent Positive lon 4200V Sweep Gas O Arb Ion Transfer Tube Temperature 350℃ CID Gas 2 mTorr 表2.(B)随时间变化的喷雾电压 Time (min) Voltage (V) 0 0 0.1 4200 1.1 0 Compound Precursor(m/z) Product(m/z) Collision Energy (V) RF Lens (V) Voriconazole 350.1 224.1 19 59 Voriconazole 350.1 263.1 25 59 Voriconazole 350.1 281.2 16 59 Posaconazole 701.3 344.1 43 117 Posaconazole 701.3 370.2 43 117 Posaconazole 701.3 614.3 35 117 Itraconazole 705.2 335.1 42 115 Itraconazole 705.2 348.1 40 115 Itraconazole 705.2 392.2 36 115 Voriconazole D3 353.0 224.2 20 54 Voriconazole D3 353.0 266.2 25 54 Voriconazole D3 353.0 284.1 18 54 Itraconazole D4 709.2 339.3 43 119 Itraconazole D4 709.2 352.0 40 119 Itraconazole D4 709.2 396.4 36 119 当。干燥血清斑点的总分析时间约为2分钟。这包括了提取步骤以及质谱分析，这两个过程都使用了 VeriSpray样品板自动进行。 三种抗真菌药物同时成功定量(图3)。每条校准曲线的相关系数(R²)大于0.99，说明线性良好。检出限(表4)远低于通常在真菌感染研究中发现的浓度，并且测定的测量范围与所提供的参考实验室 HPLC-MS/MS分析相 图3.(A)伊曲康唑、(B)白沙康唑和、(C)伏立康唑在混合人体血清中的校正曲线 表4.血清中 PaperSpray 的定量结果 Target R2 Limits of Detection in Serum (ng/mL) Target Range Itraconazole 0.9990 26 >500 ng/mL (local infection ) >1000 ng/mL (systemic infection) Posaconazole 0.9973 43 ~1000 ng/mL (trough) Voriconazole 0.9996 16 ~1000 ng/mL (steady-state) 搭载 VeriSpray 离子源的 PaperSpray 质谱仪能够对人体血清中的抗真菌药物进行准确定量。除提供快速分析外，这种易于实施的工作流程无需进行额外的样品预处理或分离。本方法测定的动态线性范围包括普通临床研究的测量范围。 ( 1. Wang， H， L iu， J.； Cooks， R . G.； Ouyang， Z， PaperSpray for Direct Analysis of Complex Mixtur esUsing Mass S pectrometry. Angevvandte Chem1eInternational Editio n 2010，49(5)，877-800. ) ( 2. Manicke， N. E.，Bills，B. J.， Zhang， C， A nalysisof bioflu1ds by paper spray MS a dvances andchallenges. Bioamlysis 2016，8(6)，589-606 ) ThermoFisher 伏立康唑，伊曲康唑和泊沙康唑（ 图1）是用于治疗严重侵袭性真菌感染的药物。侵袭性真菌感染在免疫防御严重受损的个体中非常普遍，包括在器官或骨髓移植后接受免疫抑制药物治疗的个体，或接受癌症治疗化疗的个体。 在儿科人群中使用抗真菌药物尤其具有挑战性，因其个体间和不同年龄段的药代动力学变化很大。在临床研究中，根据快速准确的药物监测结果调整剂量有助于控制感染。PaperSpray 质谱仪，于2010 年首次描述1，是一种快速的，直接在纸上或其他多孔基质上检测生物液体斑点的方法。在PaperSpray 技术中，一种或多种分析物的提取和电离发生在含有样品的多孔基质中。文献中的一些报道已经证明了直接对生物体液2 中的小分子（包括治疗药物和非法药物）进行定量分析。 PaperSpray MS 在无需样品制备和较短的周转时间内仍然保持着良好定量表现和灵敏度，引起了人们的极大兴趣。在本研究中，我们介绍了在TSQ Altis 三重四极杆质谱仪上采用VeriSpray PaperSpray 离子源对三种抗真菌药物（泊沙康唑，伊曲康唑和伏立康唑）进行定量的方法。VeriSpray 系统具有稳定，快速及自动化的PaperSpray分析性能。样品存储，提取和电离都在VeriSpray 样品板上进行，样品板上有24 个独立的纸喷嘴，每一个都能单独分析一个样品（图2A）。通过VeriSpray 离子源（图2B）在几分钟内直接从干燥的生物液体斑点自动进行样品板分析。