注射用水溶性维生素中叶酸，生物素检测方案(液相色谱柱)

注射用水溶性维生素的分析(2) —叶酸，生物素 客户提供了注射用水溶性维生素粉针剂及对照品(叶酸，生物素)，要求本实验室依据客户所提供方选择合适色谱柱，满足方法中对叶酸，生物素及其前后相邻杂质的分离要求，进而达到准确定量的目的。 首先，依据客户提供的色谱条件我们尝试了使用中等极性色谱柱 CAPCELL PAK C18MGII S5； 4.6 mm i.d.×150 mm (A4AB 07251)， 分析对照品溶液与供试品溶液，结果如图1所示，对照品溶液中叶酸及生物素得到了良好的分离结果；在分析供试品溶液时，叶酸与其后杂质峰能够得到分离度为1.83的良好分离结果。 图1 CAPCELL PAK C18 MGII (150mm)分析对照品及供试品溶液结果注*峰上所标数字为分离度，下同。 HPLC Conditions ： 色谱柱： CAPCELL PAK C18 MGII S5；4.6 mm i.d.×150 mm (A4AB 07251) 流动相： 磷酸二氢钾缓冲溶液(取磷酸二氢钾2.27 g，加水溶解并稀释至5000mL)/ 乙腈=93/7，用磷酸调整 pH至3.0 流速1.5 mL/min温度检测样品 30°℃ PDA 200 nm 叶酸对照品储备溶液：取叶酸对照品 32 mg于100 mL容量瓶中，用2mmol/L氢氧化钠溶液溶解稀释至刻度，摇匀。 生物素对照品储备溶液：取生物素12mg， 用乙醇/水=1/3溶液溶解稀释至刻度，摇匀。 对照品溶液：分别取叶酸对照品储备液5mL 及生物素对照品储备液2mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 进样量： 20pL 为提高分离能力，使叶酸峰与其后杂质峰分的更远，我们尝试将色谱柱长度由150mm换为 250mm，再一次分析供试品及对照品溶液，结果发现叶酸和生物素保留时间均明显延长，叶酸峰由16.97 min 延长到29.03 min， 此时叶酸峰与其后相邻杂质峰能够得到更好的分离，分离度为4.23，但同时也发现生物素峰被包于杂质峰中(如图2)。 图2 CAPCELL PAK C18 MGII(250mm)分析对照品及供试品溶液结果 HPLC Conditions ： 色谱柱：CCAPCELL PAK C18 MGII S5； 4.6 mm i.d.x250mm (A4AD 11407) 流动相： 磷酸二氢钾缓冲溶液(取磷酸二氢钾2.27 g，加水溶解并稀释至5000mL)/乙腈=93/7，用磷酸调整 pH 至3.0 流速1.5mL/min温度检测样品 30°C PDA 200 nm 叶酸对照品储备溶液：取叶酸对照品 32 mg于 100 mL 容量瓶中，用2 mmol/L 氢氧化钠溶液溶解稀释至刻度，摇匀。 生物素对照品储备溶液：取生物素12mg，用乙醇/水=1/3溶液溶解稀释至刻度，摇匀。 对照品溶液：分别取叶酸对照品储备液5mL 及生物素对照品储备液2mL于 100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 进样量： 20pL 为使客户有更多色谱柱选择，本实验室也尝试了高碳载量的 SUPERIOREX ODS 色谱柱对对照品溶液及供试品溶液进行分析，同样能够得到待测组分与前后杂质峰的良好分离，分离度均在2.0以上；同时，我们也发现在分析供试品时，由于供试品中复杂基质的影响，叶酸峰会出现一定的拖尾现象(如图3)。 图3 SUPERIOREX ODS 分析对照品及供试品溶液结果 HPLC Conditions ： 色谱柱： SUPERIOREX ODS S5： 4.6 mm i.d. ×150 mm (AZAB 12684) 流动相： 磷酸二氢氢缓冲溶液(取磷酸二氢钾2.27g，加水溶解并稀释至5000mL)/乙腈=91/9，用磷酸调整pH至3.0(原条件为93/7) 流1.5mL/min温 检样 30°C PDA200 nm 叶酸对照品储备溶液：取叶酸对照品 32 mg 于 100 mL容量瓶中，用2 mmol/L 氢氧化钠溶液溶解稀释至刻度，摇匀。生物素对照品储备溶液：取生物素12mg，用乙醇/水=1/3溶液溶解稀释至刻度，摇匀。对照品溶液：分别取叶酸对照品储备液5mL 及生物素对照品储备液2mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 进样量： 20 pL 我们也尝试使用可以在100%水系流动相下使用的高极性 AQ 色谱柱分析供试品溶液及对照品溶液，发现由于整体保留时间过长而使得生物素峰被包于杂质峰中，因此，我们尝试缩短整体保留时间，在药典规定范围内，提高流动相中有机相比例，将流动相比例由磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(93：7)调整为(91：9)，最终发现供试品中叶酸和生物素也能够与其相邻杂质峰取得良好分离结果，且分离度更佳(见图4)。 图4 CAPCELL PAK C18 AQ S3 分析对照品及供试品溶液结果 HPLC Conditions ： 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S3； 4.6 mmi.d.×150 mm (A7AB 02100) 流动相： 磷酸二氢钾缓冲溶液(取磷酸二氢钾 2.27 g，加水溶解并稀释至5000mL)/乙腈=91/9，用磷酸调整 pH至3.0(原条件为93/7) 流1.5mL/min温 检样 30°C PDA200 nm 叶酸对照品储备溶液：取叶酸对照品32 mg于100mL容量瓶中，用2 mmol/L氢氧化钠溶液溶解稀释至刻度，摇匀。生物素对照品储备溶液：取生物素12mg，用乙醇/水=1/3溶液溶溶稀释至刻度，摇匀。对照品溶液：分别取叶酸对照品储备液5mL及生物素对照品储备液2mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 进样量： 20 pL 综上实验结果，使用中等极性的 CAPCELL PAK C18 MGII S5； 4.6 mm i.d.×150 mm(A4AB 07251)和高碳载量的 SUPERIOREX ODS S5； 4.6 mmi.d. ×150 mm (AZAB12684)色谱柱，在客户原条件下，均能够实现叶酸、生物素及其相邻杂质间的良好分离；使用高极性 CAPCELL PAK C18 AQ S3； 4.6 mmi.d.×150mm (A7AB 02100)色谱柱，在药典规定流动相可调整范围内，将流动相中磷酸盐缓冲液和乙腈比例比整为91/9(原条件为93/7)，也可实现注射用水溶性维生素中叶酸和生物素及相邻杂质的良好分离。 以上三款色谱柱均可满足客户需求，客户可根据实际情况自行选择。 使用中等极性的CAPCELL PAK C18 MGII S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm（A4AB 07251）和高碳载量的SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm（AZAB 12684）色谱柱，在客户原条件下，均能够实现叶酸、生物素及其相邻杂质间的良好分离；使用高极性CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6 mm i.d. × 150 mm（A7AB 02100）色谱柱，在药典规定流动相可调整范围内，将流动相中磷酸盐缓冲液和乙腈比例调整为91 / 9（原条件为93 / 7），也可实现注射用水溶性维生素中叶酸和生物素及相邻杂质的良好分离。