头孢氨苄中有关物质检测方案(液相色谱柱)

表1各色谱柱分离度结果对比(色谱柱规格 S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm)No.31， BDA International Business Park，2 Jing Yuan Street， Beijing 2015年版《中国药典》头孢氨苄有关物质的分析 客户提供了头孢氨苄工作对照品、杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、0-苯甘氨酸、△-2-头孢孢苄对照品和80℃条件下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的 C18色谱柱，实现头孢氨苄的有关物质分析。 在头孢氨苄有关物质分析中，流动相为高水相条件，故本实验室首先尝试使用能在高水相下稳定使用的高极性色谱柱 CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm(柱号：A6AD04229)，对80℃破解所得分离度溶液进行分析，结果见图1。 Minutes 图180℃破解溶液及空白溶液分析所得色谱图 (Ci8 AQ色谱柱) *注：峰上所标数字为分离度，下同。 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相： A： 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B： 甲醇B% 2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速：1.0mL/min温检 度： 30C 测： PDA220 nm 进样量：20uL 样 占：80℃破解溶液(客户提供)，空白溶液为流动相A ( 如图1， 头 孢氨苄主峰保留时间为 21.09 min ， 主峰与前后杂质分离度分别为2.42和3.37，达到药典要求的基线分离。 ) 进一步分析杂质对照品溶液和供和品溶液，如图2，杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 (7-ADCA)和α-苯甘氨酸的分离度为11.19，符合药典要求。 a-苯甘氨酸 ： 7-ADCA Minutes 图2杂质对照品溶液分析所得色谱图 (Cis AQ 色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相： A：0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B：甲醇B%2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速：：11.0 mL/ min温检 度： 30C 测： PDA 220 nm 进样量：20pL 样品：取两杂质对照品各10 mg， 置同一100 mL量瓶中，加入20 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液*超声溶解，以流动相A稀释至刻度，摇匀，量取2mL于20 mL量瓶中，以流动相A稀释至刻度。 *pH 7.0磷酸盐缓冲液：2.84g 无水磷酸氢二钠加入80mL水，以磷酸调pH至7.0， 加水至100mL。 如图3，对供试品溶液进行分析，各杂质间分离度良好。 Minutes 图3头孢氨苄供试品溶液分析所得色谱图 (Ci8 AQ色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相： A：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调pH至5.0) B：甲醇B%2% (0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速：1.0 mL/min温检 度： 30℃ 测： PDA220nm 进样量：20pL 样 品：1mg/mL(取头孢氨苄 10 mg于10mL容量瓶中，加流动相A至刻度，摇匀) 客户要求考察低浓度(10ug/mL)下头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况，在客户允许调整柱温(30℃~40℃)的前提下进行分析，如图4，当柱温设定为30℃时，头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳，为1.17. 图4头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液分析所得色谱图 (Cis AQ色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250mm (A6AD 04229) 流动相： A： 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B：甲醇B% 2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速：1.0 mL/ min温检 度： 30℃ 测： PDA 220nm 进样量：20pL 样品品：10 pg/mL 为使客户有更多色谱柱选择，本实验室又进一步尝试了资生堂中等极性色谱柱 CAPCELL PAK C18MGII以及高碳载量色谱柱 SUPERIOREX ODS 进行分析。 使用 CAPCELL PAK C18 MGII 色谱柱在30℃条件下对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄进行分离，分离度为1.05，分离效果不及 CAPCELL PAK C18AQ；使用 SUPERIOREX ODS 色谱柱进行分析，分离度为1.18，分离效果略优于 AQ 柱，但在分析破解所得分离度溶液时，杂质峰形及分离效果不佳。 在对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，本实验室也尝试使用键和金刚烷基团的高表面极性色谱柱 CAPCELL PAK ADME 和键合五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的 CAPCELLPAK PFP 色谱柱进行尝试。 由于 ADME 色谱柱保留较强，在原梯度条件下未得到待测物洗脱，提高梯度条件中有机相比例后，亦未得到理想的分离效果；而使用 CAPCELL PAK PFP S5； 4.6 mm i.d.×250 mm(TQAD01002)色谱柱进行分析，能得到4.84的分离度(见图5)。表1为各色谱柱分离度结果对比。 图5头头氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果 (PFP 色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK PFP S5；4.6 mm i.d.×250 mm (TQAD 01002) 流动相： A： 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试式调 pH至5.0) B：甲醇 B%2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速：1.0mL/ min温检 度： 30℃ 测： PDA 220 nm 进样量：20pL 样 品：10 pg/mL 色谱柱 分离度 CAPCELL PAK C1 AQ 1.17 SUPERIOREX ODS 1.18 CAPCELL PAK C18 MGII 1.05 CAPCELL PAK PFP 4.84 进一步，使用 PFP 色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液、杂杂对照溶液、△-2-头孢氨苄对照溶液、高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离，主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78(见图6)，杂质对照品溶液中 7-ADCA 和α-苯甘氨酸的分离度为7.28(见图7)。 Minutes 图6供试品溶液、空白及△-2-头孢氨苄溶液分析所得色谱图(PFP 色谱柱) 图780℃破解溶液及杂质对照溶液分析所得色谱图 (PFP色谱柱) 综上实验结果，在 Ci8系列色谱柱中，使用资生堂 CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm(A6AD04229)色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优，能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中，由于浓度较高，△-2-头孢氨苄被包于主峰中，客户反馈属正常现象，单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况，能够达到1.17的分离度结果。 在头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，相比 C18柱，资生堂 CAPCELL PAK PFP S5；4.6mm i.d. ×250 mm (TQAD01002)色到柱能够达到分离度为4.84的良好分离结果，在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中，能够得到满足药典分离要求的良好结果，供客户参考。 LC Application Lab， Shiseido China Economic Technological Development Zone，Beijing， China 100176 Phone 010-5845-1809， FAX 010-6785-6882 2015年版《中国药典》头孢氨苄有关物质的分析 客户提供了头孢氨苄工作对照品、杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、α-苯甘氨酸、△-2-头孢氨苄对照品和80℃条件下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的C18色谱柱，实现头孢氨苄的有关物质分析。在头孢氨苄有关物质分析中，流动相为高水相条件，故本实验室首先尝试使用能在高水相下稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（柱号：A6AD04229） ，对80℃破解所得分离度溶液进行分析，结果见图1。图1 80℃破解溶液及空白溶液分析所得色谱图（C18 AQ色谱柱）*注：峰上所标数字为分离度，下同。如图1，头孢氨苄主峰保留时间为21.09 min，主峰与前后杂质分离度分别为2.42和3.37，达到药典要求的基线分离。 进一步分析杂质对照品溶液和供试品溶液，如图2，杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）和α-苯甘氨酸的分离度为11.19，符合药典要求。 图2 杂质对照品溶液分析所得色谱图（C18 AQ色谱柱）如图3，对供试品溶液进行分析，各杂质间分离度良好。图3 头孢氨苄供试品溶液分析所得色谱图（C18 AQ色谱柱）客户要求考察低浓度（10 μg/mL）下头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况，在客户允许调整柱温（30℃~40℃）的前提下进行分析，如图4，当柱温设定为30℃时，头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳，为1.17。图4 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液分析所得色谱图（C18 AQ色谱柱）为使客户有更多色谱柱选择，本实验室又进一步尝试了资生堂中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MGII以及高碳载量色谱柱SUPERIOREX ODS进行分析。使用CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱在30℃条件下对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄进行分离，分离度为1.05，分离效果不及CAPCELL PAK C18 AQ；使用SUPERIOREX ODS色谱柱进行分析，分离度为1.18，分离效果略优于AQ柱，但在分析破解所得分离度溶液时，杂质峰形及分离效果不佳。 在对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，本实验室也尝试使用键和金刚烷基团的高表面极性色谱柱CAPCELL PAK ADME和键合五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的CAPCELL PAK PFP色谱柱进行尝试。由于ADME色谱柱保留较强，在原梯度条件下未得到待测物洗脱，提高梯度条件中有机相比例后，亦未得到理想的分离效果；而使用CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱进行分析，能得到4.84的分离度（见图5）。表1为各色谱柱分离度结果对比。图5 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果（PFP色谱柱）表1 各色谱柱分离度结果对比（色谱柱规格S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm）进一步，使用PFP色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液、杂质对照溶液、△-2-头孢氨苄对照溶液、高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离，主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78（见图6），杂质对照品溶液中7-ADCA和α-苯甘氨酸的分离度为7.28（见图7）。图6 供试品溶液、空白及△-2-头孢氨苄溶液分析所得色谱图（PFP色谱柱）图7 80℃破解溶液及杂质对照溶液分析所得色谱图（PFP色谱柱）综上实验结果，在C18系列色谱柱中，使用资生堂CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（A6AD04229）色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优，能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中，由于浓度较高，△-2-头孢氨苄被包于主峰中，客户反馈属正常现象，单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况，能够达到1.17的分离度结果。在头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，相比C18柱，资生堂CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱能够达到分离度为4.84的良好分离结果，在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中，能够得到满足药典分离要求的良好结果，供客户参考。            LC Application Lab, Shiseido ChinaNo.31, BDA International Business Park,2 Jing Yuan Street, BeijingEconomic Technological Development Zone,Beijing, China 100176Phone 010-5845-1809, FAX 010-6785-6882