表1各色谱柱分离度结果对比(色谱柱规格 S5; 4.6 mm i.d. ×250 mm)No.31, BDA International Business Park,2 Jing Yuan Street, Beijing 2015年版《中国药典》头孢氨苄有关物质的分析 客户提供了头孢氨苄工作对照品、杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、0-苯甘氨酸、△-2-头孢孢苄对照品和80℃条件下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的 C18色谱柱,实现头孢氨苄的有关物质分析。 在头孢氨苄有关物质分析中,流动相为高水相条件,故本实验室首先尝试使用能在高水相下稳定使用的高极性色谱柱 CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. ×250 mm(柱号:A6AD04229),对80℃破解所得分离度溶液进行分析,结果见图1。 Minutes 图180℃破解溶液及空白溶液分析所得色谱图 (Ci8 AQ色谱柱) *注:峰上所标数字为分离度,下同。 HPLC Conditions 色谱柱: CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相: A: 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B: 甲醇B% 2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速:1.0mL/min温检 度: 30C 测: PDA220 nm 进样量:20uL 样 占:80℃破解溶液(客户提供),空白溶液为流动相A ( 如图1, 头 孢氨苄主峰保留时间为 21.09 min , 主峰与前后杂质分离度分别为2.42和3.37,达到药典要求的基线分离。 ) 进一步分析杂质对照品溶液和供和品溶液,如图2,杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 (7-ADCA)和α-苯甘氨酸的分离度为11.19,符合药典要求。 a-苯甘氨酸 : 7-ADCA Minutes 图2杂质对照品溶液分析所得色谱图 (Cis AQ 色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱: CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相: A:0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B:甲醇B%2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速::11.0 mL/ min温检 度: 30C 测: PDA 220 nm 进样量:20pL 样品:取两杂质对照品各10 mg, 置同一100 mL量瓶中,加入20 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液*超声溶解,以流动相A稀释至刻度,摇匀,量取2mL于20 mL量瓶中,以流动相A稀释至刻度。 *pH 7.0磷酸盐缓冲液:2.84g 无水磷酸氢二钠加入80mL水,以磷酸调pH至7.0, 加水至100mL。 如图3,对供试品溶液进行分析,各杂质间分离度良好。 Minutes 图3头孢氨苄供试品溶液分析所得色谱图 (Ci8 AQ色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱: CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d.×250 mm (A6AD 04229) 流动相: A:0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调pH至5.0) B:甲醇B%2% (0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速:1.0 mL/min温检 度: 30℃ 测: PDA220nm 进样量:20pL 样 品:1mg/mL(取头孢氨苄 10 mg于10mL容量瓶中,加流动相A至刻度,摇匀) 客户要求考察低浓度(10ug/mL)下头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况,在客户允许调整柱温(30℃~40℃)的前提下进行分析,如图4,当柱温设定为30℃时,头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳,为1.17. 图4头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液分析所得色谱图 (Cis AQ色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱: CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d.×250mm (A6AD 04229) 流动相: A: 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调 pH至5.0) B:甲醇B% 2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速:1.0 mL/ min温检 度: 30℃ 测: PDA 220nm 进样量:20pL 样品品:10 pg/mL 为使客户有更多色谱柱选择,本实验室又进一步尝试了资生堂中等极性色谱柱 CAPCELL PAK C18MGII以及高碳载量色谱柱 SUPERIOREX ODS 进行分析。 使用 CAPCELL PAK C18 MGII 色谱柱在30℃条件下对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄进行分离,分离度为1.05,分离效果不及 CAPCELL PAK C18AQ;使用 SUPERIOREX ODS 色谱柱进行分析,分离度为1.18,分离效果略优于 AQ 柱,但在分析破解所得分离度溶液时,杂质峰形及分离效果不佳。 在对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中,本实验室也尝试使用键和金刚烷基团的高表面极性色谱柱 CAPCELL PAK ADME 和键合五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的 CAPCELLPAK PFP 色谱柱进行尝试。 由于 ADME 色谱柱保留较强,在原梯度条件下未得到待测物洗脱,提高梯度条件中有机相比例后,亦未得到理想的分离效果;而使用 CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d.×250 mm(TQAD01002)色谱柱进行分析,能得到4.84的分离度(见图5)。表1为各色谱柱分离度结果对比。 图5头头氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果 (PFP 色谱柱) HPLC Conditions 色谱柱: CAPCELL PAK PFP S5;4.6 mm i.d.×250 mm (TQAD 01002) 流动相: A: 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试式调 pH至5.0) B:甲醇 B%2%(0min)→2%(1min)→30%(20min)→2%(23min)→2%(30min) 流速:1.0mL/ min温检 度: 30℃ 测: PDA 220 nm 进样量:20pL 样 品:10 pg/mL 色谱柱 分离度 CAPCELL PAK C1 AQ 1.17 SUPERIOREX ODS 1.18 CAPCELL PAK C18 MGII 1.05 CAPCELL PAK PFP 4.84 进一步,使用 PFP 色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液、杂杂对照溶液、△-2-头孢氨苄对照溶液、高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离,主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78(见图6),杂质对照品溶液中 7-ADCA 和α-苯甘氨酸的分离度为7.28(见图7)。 Minutes 图6供试品溶液、空白及△-2-头孢氨苄溶液分析所得色谱图(PFP 色谱柱) 图780℃破解溶液及杂质对照溶液分析所得色谱图 (PFP色谱柱) 综上实验结果,在 Ci8系列色谱柱中,使用资生堂 CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. ×250 mm(A6AD04229)色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优,能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中,由于浓度较高,△-2-头孢氨苄被包于主峰中,客户反馈属正常现象,单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况,能够达到1.17的分离度结果。 在头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中,相比 C18柱,资生堂 CAPCELL PAK PFP S5;4.6mm i.d. ×250 mm (TQAD01002)色到柱能够达到分离度为4.84的良好分离结果,在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中,能够得到满足药典分离要求的良好结果,供客户参考。 LC Application Lab, Shiseido China Economic Technological Development Zone,Beijing, China 100176 Phone 010-5845-1809, FAX 010-6785-6882 2015年版《中国药典》头孢氨苄有关物质的分析 客户提供了头孢氨苄工作对照品、杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、α-苯甘氨酸、△-2-头孢氨苄对照品和80℃条件下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的C18色谱柱,实现头孢氨苄的有关物质分析。在头孢氨苄有关物质分析中,流动相为高水相条件,故本实验室首先尝试使用能在高水相下稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm(柱号:A6AD04229) ,对80℃破解所得分离度溶液进行分析,结果见图1。图1 80℃破解溶液及空白溶液分析所得色谱图(C18 AQ色谱柱)*注:峰上所标数字为分离度,下同。如图1,头孢氨苄主峰保留时间为21.09 min,主峰与前后杂质分离度分别为2.42和3.37,达到药典要求的基线分离。 进一步分析杂质对照品溶液和供试品溶液,如图2,杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和α-苯甘氨酸的分离度为11.19,符合药典要求。 图2 杂质对照品溶液分析所得色谱图(C18 AQ色谱柱)如图3,对供试品溶液进行分析,各杂质间分离度良好。图3 头孢氨苄供试品溶液分析所得色谱图(C18 AQ色谱柱)客户要求考察低浓度(10 μg/mL)下头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况,在客户允许调整柱温(30℃~40℃)的前提下进行分析,如图4,当柱温设定为30℃时,头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳,为1.17。图4 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液分析所得色谱图(C18 AQ色谱柱)为使客户有更多色谱柱选择,本实验室又进一步尝试了资生堂中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MGII以及高碳载量色谱柱SUPERIOREX ODS进行分析。使用CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱在30℃条件下对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄进行分离,分离度为1.05,分离效果不及CAPCELL PAK C18 AQ;使用SUPERIOREX ODS色谱柱进行分析,分离度为1.18,分离效果略优于AQ柱,但在分析破解所得分离度溶液时,杂质峰形及分离效果不佳。 在对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中,本实验室也尝试使用键和金刚烷基团的高表面极性色谱柱CAPCELL PAK ADME和键合五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的CAPCELL PAK PFP色谱柱进行尝试。由于ADME色谱柱保留较强,在原梯度条件下未得到待测物洗脱,提高梯度条件中有机相比例后,亦未得到理想的分离效果;而使用CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm(TQAD01002)色谱柱进行分析,能得到4.84的分离度(见图5)。表1为各色谱柱分离度结果对比。图5 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果(PFP色谱柱)表1 各色谱柱分离度结果对比(色谱柱规格S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm)进一步,使用PFP色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液、杂质对照溶液、△-2-头孢氨苄对照溶液、高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离,主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78(见图6),杂质对照品溶液中7-ADCA和α-苯甘氨酸的分离度为7.28(见图7)。图6 供试品溶液、空白及△-2-头孢氨苄溶液分析所得色谱图(PFP色谱柱)图7 80℃破解溶液及杂质对照溶液分析所得色谱图(PFP色谱柱)综上实验结果,在C18系列色谱柱中,使用资生堂CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm(A6AD04229)色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优,能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中,由于浓度较高,△-2-头孢氨苄被包于主峰中,客户反馈属正常现象,单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况,能够达到1.17的分离度结果。在头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中,相比C18柱,资生堂CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm(TQAD01002)色谱柱能够达到分离度为4.84的良好分离结果,在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中,能够得到满足药典分离要求的良好结果,供客户参考。 LC Application Lab, Shiseido ChinaNo.31, BDA International Business Park,2 Jing Yuan Street, BeijingEconomic Technological Development Zone,Beijing, China 100176Phone 010-5845-1809, FAX 010-6785-6882