动物源食品中土霉素检测方案(固相萃取仪)

Preekem 全自动固相萃取-高效液相色谱串联质谱联用法检测动物源食品中的四环素类药物 编号： ANIET151110 摘要：参考《GB21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》标准，建立了利用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱串联质谱检测鱼肉、鸭肉等动物源食品中四环素类药物的方法。样品经乙腈提取，正己烷除油， HLB柱净化，转溶定容过滤后，用高效液相色谱分离，串联质谱检测。结果表明回收率良好，重现性高。 关键词：四环素类药物，EXTRA， HPLC-MS/MS 1引言 四环素类药物(Tetracylcines， TCs)被广泛应用于食用性动物疾病的治疗和药物添加剂中，用于防治肠道感染和促进生产，容易诱导耐药菌株和造成食品残留。四环素类药物主要包括天然四环素(四环素、土霉素、金霉素、去甲基金霉素等)和半合成四环素(甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺四环素等)。在食用性动物的养殖过程中，四环素类药物的给药可通过几种方式：：口服(添加到饲料或饮用水中)、注射及通过乳腺注入。若人体长时间摄入四环素残留超标的食品，四环素会在人体内蓄积，其可在肝脏中富集，造成肝脏损害，主要经肾脏排泄，肾功能障碍时易出现消削半衰期延长，还会形成“四环素牙”，抑制白细胞影响免疫系统。许多国家对四环素类药物残留规定了最大残留限量，并实施监控。下表为中国的在动物性食品中的最大残留限量规定。 表1中国已批准的动物性食品中最高残留限量规定 名称 动物种类 靶组织 残留限量 (mg/kg) 土霉素/金霉素/四环素 所有食品动物 肌肉 100 Oxytetracycline/Chlortetracycline/ 300 Tetracycline 600 牛/羊 100 禽 200 鱼/虾 100 ( 本文参考《GB21317-2007 动物源性食品中四环素类浅药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效 ) 液相色谱法》I，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合高效液相色谱-串联质谱联用(High PerformanceLiquid Chromatography- Triple Quad Mass Spectrometry， HPLC-MS/MS)检测6种四环素类药物在鱼肉、鸭肉中残留量的方法。在乙腈提取、正己烷除油后，采用 EXTRA 全自动固相萃取仪进行样品净化，自动完成SPE 柱活化、样上上样、淋洗、目标物洗脱和收集等步骤，收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用HPLC-MS/MS 检测。 表26种四环素类药物的分子结构式 Compound CAS Molecular Formula 土霉素 79-57-2 57-62-5 60-54-8 6153-64-6 HO. QHo. )HOH Oxytetracycline H2N 0 O OH NH2 金霉素 Chlotetracycline CIHOI OH 四环素 HO OH OHO OI H Tetracycline NH2 .OH 强力霉素 .0 Doxycycline OH OH NH2 H20 H2O HCI CI C 64-73-3 去甲基金霉素 OH Demeclocycline NH2 OH0 OH O 脱水四环素 4465-65-0 X OH OH H OH NH2 Anhydrotetracycline 0 HCI 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)：分析纯级； 乙腈、正己烷、甲醇、甲酸、二氯甲烷：色谱纯级； 含 0.1%甲酸的乙腈溶液：取1000 uL甲酸，用乙腈溶解并稀释至1000 mL； 乙腈饱和的正己烷；正己烷中加入一定量乙腈，剧烈振荡后静置分层，上层即为所需； 5%甲醇水溶液：取5mL甲醇，用水溶解并稀释至 100 mL； 50%甲醇二氯甲烷溶液：取50mL甲醇与 50mL二氯甲烷混匀； 定容溶剂：取20mL甲醇与80 mL 水混匀得25%甲醇水溶液，再加入100 pL甲酸，混匀得含0.1%甲酸的25%甲醇水溶液，即为定容溶剂。 100 ug/mL 四环素类药物标准储备液：分别准确取取标准品1mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100 ug/mL 的四环素类药物标准储备液，-20℃以下保存； 实验用水均为超纯水(电屯率=18MQ·cm)，取自Milli-Q制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱： HLB， 60mg /3 mL， 上海安谱公司； 全自动固相萃取仪： EXTRA，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 高效液相色谱串联质谱联用仪： Agilent 1290 infinity - 6490 Triple Quad MS； 0.22 u.m PVDF 针头式过滤器：天津津腾实验设备有限公司； 分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮吹仪；移液枪；均质仪； 50 mL离心管；梨形瓶；玻璃滴管；收集管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取(5.00±0.01)g绞碎后的样品，置于50 ml 离心管中，加入0.5 g Na2EDTA、25 mL 0.1%甲酸乙腈溶液、20 mL乙腈饱和的正己烷，均质 3 min 后以 3500 r/min 离心5 min， 将中间层乙腈溶液收集于梨形瓶中，样品残渣再加入25 mL 含0.1%甲酸的乙腈溶液，重复萃取操作，合并乙腈提取溶液，在40℃下水 浴减压浓缩至干。残液中准确加入20 mL 超纯水及约 10 mL 正己烷，振荡后弃去正己烷层，重复一次，准确移取下层清液4 mL 于进样管中待净化。 3.1.2净化 HLB 固相萃取柱依次用5 mL 甲醇、5mL水活化，取备用液过柱，流速1mL/min/，用5mL水及5mL 5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，用8mL甲醇及4mL50%甲醇二氯甲烷溶液洗脱，收集洗脱液。 3.1.3定容 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以定容溶剂定容至1.0 ml， 经0.22 um滤膜过滤，滤液待进样。 3.2检测方法 3.2.1EXTRA 净化程序 EXTRA 净化程序如表3所示。 表3全自动固相萃取仪检测动物性食品中四环素类药物的净化程序 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 8 90 90 活化 甲醇 5 20 水 5 20 上样 样品 4 20 空气 0.5 60 清洗 外针 水 8 90 90 淋洗 水 5 20 2 5%甲醇水溶液 5 60 2 空气 50 60 60 洗脱 甲醇 8 20 50%甲醇二氯甲烷溶液 4 60 20 空气 50 60 60 3.2.2色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Kinetex C18柱，长度100 mm， 内径3.0mm， 涂层粒径2.6 um； 柱温30℃， 流速：0.25mL/min， 进样量：10.0pL。 流动相为超纯水(A)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序如下： 0-2min 10% B， 2-10 min10%-15%B， 10-12 min 15%B， 12.01-16 min 25%B， 16-24 min 25%-80%B，24-16 min 80%B， 26.01-30 min10%B。 3.2.3质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应选择监测 (Multiple Reaction Monitoring， MRM)模式；鞘气温度 (Sheath Gas Temperature) 350℃，鞘气流速(Sheath Gas Flow) 11 L/min， 氮气发生器提供；干燥气温度(Dry Gas Temperature) 160℃，干燥气流速 (Gas Flow) 16 L/min，氮气发生器提供；雾化气压力(Nebulizer Pressure) 30 psi；喷嘴电压 (Nozzle Voltage) 1500V； 碰撞气 (Collision Gas) 为高纯氮气，，气体纯度≥99.999%。质谱 MRM 采集参数见表4。 表4目标物的LC-MS/MS MRM参数、二工作曲线线性范围、相关系数和仪器检出限 Compound MS Parameters Linear IDL PI DI CE Range R2 (ug/L) m/z) (m/z) (eV) (ug/L) 土霉素 461.1 443.1/426.1* 5/15 5-200 0.9992 1.0 金霉素 479.1 462.1/444.1* 10/15 5-200 0.9984 1.0 四环素 445.1 427.1/410.0* 5/15 5-200 0.9969 1.0 强力霉素 445.1 410.1/428.1* 20/15 5-200 0.9977 1.0 去甲基金霉素 465.2 430.0/448.0* 20/15 10-200 0.9977 5.0 脱水四环素 427.0 410.0/154.0* 35/20 10-200 0.9921 5.0 4结果与讨论 4.1基底加标回收率及精密度 在(5.00±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到 100 ng (20 ug/kg)及 200 ng (40 ug/kg)， 各三个平行，考察方法的样品加标回收率 (Recovery， Rec) 和重现性。样品加标回收率、相对标准偏差(RSD)如表5、表6所示： 表5鱼肉中四环素类药物加标回收率及相对标准示差(n=3) Compound 20 ug/kg 40 ug/kg Rec% RSD% Rec% RSD% 土霉素 80.5 2.3 86.4 3.9 金霉素 77.4 5.3 84.4 8.3 四环素 75.3 14.2 91.1 12.4 强力霉素 83.9 15.5 86.6 12.5 去甲基金霉素 41.6 10.5 50.6 3.1 脱水四环素 67.8 13.1 74.0 8.1 表6鸭肉中四环素类药物加标回收率及相对标准偏差(n=3) Compound 20 ug/kg 40 ug/kg Rec% RSD% Rec% RSD% 土霉素 87.6 0.5 82.5 2.8 金霉素 84.6 11.0 83.9 10.4 四环素 75.8 5.7 78.8 7.0 强力霉素 84.3 5.9 109.7 6.3 去甲基金霉素 37.3 3.6 54.5 10.3 脱水四环素 46.8 9.7 68.6 9.2 4.2检测结果 四环素类药物是一类酸碱两性的强极性化合物，易与金属离子及蛋白质络合。选择的6种目标物中土霉素、金霉素和强力霉素关注度较广，去甲基金霉素、脱水四环素相关检测较少，因其脂溶性较强，在动物基底的检测中回收率相对其他几种较差，但从加标回收的相对标准偏差来看，重现性良好。 5结论 本方法采用乙腈对鱼肉、鸭肉等动物源食品中的四环素类药物进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用高效液相色谱-串联质谱联用进行检测。检测结果表明，处去甲基金霉素和脱水四环素外，以鱼肉及鸭肉为基底，其他几种四环素类药物在 20 ug/kg 及 40 ug/kg 的加标浓度下，回收率在75.3%-109.7%之间，相对标准偏差在 0.5%-15.5%之间。 ( 参考文献 ) [1]《GB21317-2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》.