橘皮中黄酮类化合物检测方案(超临界萃取)

食品科学※工艺技术1502008，Vol.29，No.09 超临界二氧化碳萃取橘皮中黄酮类化合物的工艺研究 吕凛，陶宁萍* (上海海洋大学食品学院，上海 200090) 摘要：本实验研究了 CO2超临界流体萃取橘皮中黄酮类化合物的影响因素，在单因素试验的基础上，以总黄酮提取率为主要评价指标，进行了L9(34)正交优化。结果表明，对萃取率影响主次次序为：夹带剂用量>萃取压力>萃取温度>萃取时间。生产最优工艺条件为：萃取温度为55℃、萃取压力200BAR(1BAR=0.1MPa)、萃取时间为150min、夹带剂用量0.35ml/min。黄酮类化合物的提取率为 2.723%。 关键词：超临界二氧化碳萃取；橘皮；总黄酮 Study on Supercritical CO2 Extraction Process of Flavonoids from Citrus Peels LU Lin， TAO Ning-ping* (College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 200090，China) Abstract： The effects of the extraction parameters on the yield of flavonoids from Citrus peels were studied， the processparameters were optimized by L，(3) orthogonal tests based on single factor tests with the yield of total flavonoids as index. Theresults showed that the order of the extraction parameters affecting the yield of flavonoids is as follows： dosage of cosolvent>pressure>temperature>time. The optimal process parameters are 55 ℃， 200 BAR (1 BAR=0.1 MPa)， 150 min and 0.35 ml/min. The maximum extraction yield is 2.723%. Key words： supercritical carbon dioxide extraction； citrus peels； total flavonoids 中图分类号：O658；O623.54 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)09-0150-05 柑橘在我国有非常丰富的资源，新鲜柑橘皮中含有丰富的黄酮类物质成分，药理学研究表明黄酮成分是其有效活性成分，具有抗炎口、抗氧化[2-3]、抗过敏作用[4]以及降低恤液和肝脏中胆固醇的作用。在成熟的柑桔果实中，黄酮类化合物在果皮、果肉、果核中含量较高，而在果汁中含量较低，仅为1%~5%，这样柑桔经过榨汁后，剩余的下脚料可被综合利用，其综合利用方式之一是用于提取黄酮类化合物等天然活性物质[6]。充分利用来源广泛、价格低廉的废弃橘皮资源，对提高橘皮的综合利用价值是很有必要的，也是非常有意义的。 超临界流体萃取技术是从萃取到分离可一步完成，得率高、且因为萃取条件温和(Tc=31.06℃)，周期短，保护了黄酮类化合物的活性成分不发生次生化，并无有机溶剂残留，具有环境友好的特点。超临界二氧化碳萃取工艺，流程简单，操作方便，节省劳动力和大量有机溶剂，减少“三废”污染，这无疑为功能性物 质的生产提供了一种萃取、分离、制备及浓缩的新方法。国内未见有关采用超临界流体萃取技术提取橘皮中黄酮类化合物的相关报道，本研究旨在对桔皮中黄酮类化合物最佳萃取工艺条件进行研究，为未来的规模化生产提供理论支持和现实依据[8-10]。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 浙江红橘橘皮 自制。 无水乙醇(分析纯) 杭州双林化工试剂厂；；甲醇(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；芦丁(纯度为95%)Sigma-Aldrich 公司。 1.2 仪器与设备 Speed SFE超临界二氧化碳萃取仪 美国 AppliedSeparations 公司； BT224电子天平、MP4002电子天平 ( 收稿日期：20 0 8-04-21 ) ( 作者简介：吕凛(1982-)， 男 ，硕士研究生，主要从事天然功能性物质的开发利用研究。E-mail： ll v @stmail.shou.edu.cn ) ( *通讯作者：陶 宁 萍(1968-)，女，副教授，博士研究生，主要从事食品营养研 究 。E-mail： n ptao@shou.edu.cn ) 上海恒平科学仪器有限公司； UV-2000紫外可见分光光度计 尤尼科仪器有限公司； UV-1601PC紫外可见分光光度计 日本岛津公司； DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱上海精宏设备有限公司； SQ2119N多功能食品加工机上海帅佳电子科技有限公司。1 方法 1.3.1 橘皮预处理 将新鲜的橘皮切成细条状，于55℃热风干燥。磨成粉，过不同规格的筛。 1.3.2 水分含量测定 采用 GB/T 5009.32003的方法对材料测定三次，取平均值。 1.3.3 工艺流程 橘皮→切分→干燥→粉碎→过筛→称重→超临界萃取→总黄酮提取液→测定总黄酮提取率 1.3.4 超临界二氧化碳萃取的单因素条件的测定 分别对萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂的选择和用量、材料颗粒大小进行单因素试验，以初步确定各因素的影响程度及最佳提取条条。 1.3.5 改变夹带剂后的单因素试验 由于夹带剂采用了极性更强的有机溶剂甲醇。夹带剂是在纯超临界流体中加入的一种少量的、可以与之混溶的、挥发性介于被分离物质与超临界组分之间的物质。加入夹带剂后，混合溶剂的临界点相应改变[11]。因此，夹带剂种类的改变，混合物流体的临界温度和临界压力也会有所改变。 对萃取时间、温度、压力和夹带剂用量对总黄酮提取率的影响做进一步研究。 1.3.6 正交试验 在前期单因素试验的基础上，选用萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂用量四个因素进行正交试验，以总黄酮提取率为主要评价指标，采用L(34)正交表进行试验，对结果进行方差分析和显著性检验，并进行验证实验。 1.3.7 总黄酮浓度的测定方法 用紫外可见光度吸收扫描仪对芦丁对照品溶液和黄酮类化合物提取液进行190~360nm波长范围的吸光度扫描，发现有一个比较明显而且无干扰的独立峰，在芦丁对照品溶液和各种方法提取的黄酮类化合物提取液中都有存在。将310nm定为总黄酮含量的吸收波长，并用NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 体系分光光度法验证了其可靠性。得到芦丁标准曲线公式为A=0.013C+0.0067(R²=0.9996)，将提取液用无水乙醇稀释至适当倍数后直接于310nm 波长处测定吸光度。 1.4 数据处理公式 式中，C为芦丁标准曲线对应黄酮浓度(mg/L)；V为提取液体积(ml)；W为桔皮质量(g)。 2 结果与分析 2.1 单因素试验 2.1.1 萃取温度对总黄酮提取率的影响 以无水乙醇作夹带剂，萃取压力300BAR，预加夹带剂(料液比为1：1， g/ml)， 静态萃取20min， 动态萃取(夹带剂用量0.2ml/min)2h。选择萃取温度40、50、60℃。 图1 温度对总黄酮提取率影响曲线 Fig.1 Effects of extraction temperature on extraction rate 从图1可以看出，当温度低于50℃左右时，黄酮提取率随着温度的升高而升高，但温度高于50℃左右后，黄酮提取率反而减少。这是因为萃取温度对萃取效果具有双重的影响。一方面，温度升高有利于溶质挥发性的增加和提高物料的扩散系数，有利于橘皮中黄酮类化合物的萃出；另-方面，温度升高又降低了二氧化碳的浓度，减少了二氧化碳的密度，从而导致二氧化碳溶解能力的降低，不利萃取。此外，温度升高也会破坏萃取的黄酮类化合物的生理活性。因此，萃取温度的选择不宜过高。 2.1.2 萃取压力对总黄酮提取率的影响 以无水乙醇作夹带剂，萃取温度为50℃，预加夹带剂(料液比为1：1， g/ml)，静态萃取20min， 动态萃取(夹带剂用量0.2ml/min)， 2h。选择萃取压力200、300、400、500BAR。 压力的增大，使超临界二氧化碳流体的密度增大，有利于黄酮类成分的溶出，但是，超临界二氧化碳流体的扩散系数也随压力的增大而减小，又不利于黄酮类成分的溶出。由图2可知，当压力在200~300BAR范围内时，提取率随压力上升而迅速增加，而从300BAR开始提取率随压力的上升而减少。 图22压力对总黄酮提取率的影响影响曲线 Fig.2 Effects of extraction pressure on extraction rate 2.1.3 动态萃取时间对总黄酮提取率的影响 以无水乙醇作夹带剂，萃取温度50℃、萃取压力为300BAR， 预加夹带剂(料液比为1：1， g/ml)，夹带剂用量为0.2ml/min， 进行连续实验240min， 从60min开始，每30min取样一次，测定总黄酮含量，以240min的提取率为100%计，结果见图3。 图3 不同动态萃取时间对总黄酮的影响 Fig.3Effects of dynamic extraction time on extraction rate 由图3可以看出，时间越长，提取是越高，但150min后，。曲线上升缓慢，表明总黄酮浸出量很少，这是因为-般情况下，如果萃取时间太短，超临界二氧化碳流体与溶质未达到良好接触，萃取量少；萃取一定时间后，超临界流体与黄酮类化合物逐渐接近溶解平衡；再增加萃取时间，萃取得率增加有限。而且随着时间的延长，超临界萃取的能耗也在增加[12]。 2.1.4 动态萃取时夹带剂用量对总黄酮提取率的影响 以无水乙醇作夹带剂，萃取温度为50℃，萃取压力300BAR，预加夹带剂(料液比2：1， g/ml)，动态萃取2h。选择0.2、0.4、0.6ml/min，提取率如图4所示。 由图4可知，动态萃取时无水乙醇加入量为 0.4ml/min 左右时，提取率最高。随着无水乙醇用量的增大：有利于橘皮中的黄酮类化合物的溶出，使提取率升高。但是，用量过大，橘皮中的黄酮类化合物与夹带剂的接触时间变短，导致夹带剂使用效率降低。 2.1.5 夹带剂的种类对总黄酮提取率的影响 图4 无水乙醇用量对总黄酮提取率的影响 Fig.4 Effects of dosage of absolute alcohol on extraction rate 二氧化碳的分子结构决定了它对一定的分离过程有很大的局限性I13]：对于烃类和弱极性的脂溶性物质的溶解能力较好，但对于强极性的有机化合物则需加大萃取压力或使用夹带剂来实现分离。一般来说，超临界二氧化碳萃取压力越高，对设备的要求就越高，而且能耗大；因此如何采取外部措施对超临界二氧化碳萃取过程的选择溶解能力和提取率的强化就成了当前研究的新动向。 二氧化碳是非极性物质，单纯的超临界二氧化碳流体只能萃取极性较低的亲脂性物质，黄酮类物质一般极性较大。实验表明：在不加夹带剂的条件下只能得到少量易挥发性的小分子物质，黄酮类化合物的得率极低I14]， Liu C M等在实验中也发现，加入夹带剂可以显著的提高黄酮类化合物的提取率[15]。 在选择夹带剂时，选取70%乙醇、无水乙醇[15]和95%乙醇，由于有机溶剂中，甲醇的极性大于乙醇，而且甲醇的沸点比无水乙醇的沸点低，因此可能会更有利于黄酮类化合物的萃取及分离，因此选用了四种夹带剂进行实验，结果见表1。 萃取温度50℃，萃取压力300BAR， 预加夹带剂(料液比为1：1， g/ml)， 静态萃取20min， 动态萃取(夹带剂流量 0.2ml/min) 2h 的提取率如表1所示。 表1 不同夹带剂对提取率的影响 Table 1 Effects of different cosolvents on extraction rate 夹带剂 70%乙醇 95%乙醇 无水乙醇 甲醇 提取率(%) 0.318 0.195 0.331 0.455 从表1可以看出，用甲醇作夹带剂效果最好，余下的三种夹带剂中，无水乙醇的效果次之，70%乙醇的效果略低于无水乙醇，这个与 Liu C M等I15]实验得到的结果不同，这可能是萃取材料不同所致。另外两种萃取得到的提取液中不溶性的絮状沉淀较多，在后面的溶质与溶剂分离时，给后续的分离加工造成困难 2.2 改变夹带剂后的单因素试验 夹带剂由于能与二氧化碳流体混溶，形成一种不同于夹带剂也不同于二氧化碳流体的混合物。因此，夹带剂种类的改变，混合物流体的临界温度和临界压力也会有所改变。 下列的单因素试验均以甲醇作夹带剂，预加夹带剂(料液比为2：1， g/ml)， 进行单因素试验。 2.2.1 萃取温度对总黄酮提取率的影响 萃取压力300BAR， 甲醇用量0.4ml/min， 动态萃取2h。选择萃取温度为30~70℃。 图5 温度对总黄酮提取率的影响 Fig.5 Effects of extraction temperature on extraction rate 由图5可以看出，当萃取温度升高到45℃时，提取率有了明显的提高，可能甲醇-二氧化碳混合物达到了临界温度，成为超临界流体所致。到55℃时，提取率又略有提高，其中在60℃时提取率达最高0.739%，提取率较使用无水乙醇作为夹带剂时最高提取率0.507%有明显提高。在正交试验中，选定50、55和60℃为试验验。 2.2.2 萃取压力对总黄酮提取率的影响 图6 压力对总黄酮提取率影响 Fig.6 Effects of extraction pressure on extraction rate 萃取温度60℃，甲醇用量 0.4ml/min，动态萃取2h。选择萃取压力为150、200、250、300、350BAR。 由图6可以看出，从150BAR开始，提取率不断的升高，当达到250BAR时，提取率最高为1.00%。压力大于250BAR，提取率又开始下降。300BAR的提取率略低于150BAR和200BAR。根据图6，在正交试验中，选定150、200和250BAR为试验值。 2.2.3 萃取时间对总黄酮提取率的影响 萃取温度60℃，萃取压力300BAR，甲醇用量0.4 ml/min， 进行连续卖验 210min， 从60min 开始，每30min取样一次，测定总黄酮含量，t，以确定萃取时间对总黄酮提取率的影响。以210min 的提取率为100%计，结果如图7所示。 图7 萃取时间对提取率的影响 Fig.7 Effects of extractive time on results 由图7可以看出，从60min开始，提取量上升很快，到达120min后，提取量上升逐渐变慢。因此，选择90、120、150min 为正交试验的萃取时间。 2.2.4 夹带剂用量对总黄酮提取率的影响 萃取温度60℃，萃取压力300BAR，动态萃取2h，选择甲醇用量0.2、0.4、0.6ml/min。 图8 甲醇用量对提取率的影响 Fig.8 Effects of dosage of methanol on extraction rate 由图8可以看出，根据前面用无水乙醇用量的单因素试验中的结果进行甲醇用量的进一步细化，得到的结果仍然相似，为了使工业化生产产生最佳效益，在正交试验中的甲醇用量定为0.35、0.40、0.45ml/min。 2.3 正交试验 根据单因素试验结果，采用正交试验进一步优化提取工艺，因素水平表见表2，正交试验结果见表3. 表2 正交试验设计方案 Table 2 Orthogonal test design 水平 因素 A温度(℃)B压力(BAR) C时间(min) D夹带剂用量(ml/min) 1 50 150 90 0.35 2 55 200 120 0.4 3 60 250 150 0.45 表3 Lg(3)正交分析表 Table 3 Analysis and results of orthogonal test Lg(34) 组别 因 素 提取率(%) C D B 150 90 0.35 1.649 200 120 0.4 1.536 3 250 150 0.45 1.746 4 150 120 0.45 1.987 200 150 0.35 2.723 6 250 90 0.4 1.312 7 150 150 0.4 1.394 8 200 90 0.45 2.019 9 250 120 0.35 2.188 1.664 1.676 1.66 2.186 2.007 2.093 1.903 1.414 1.867 1.748 1.954 1.917 0.363 0.416 0.294 0.773 表4 方差分析表 Table 4 Analysis of variance of orthogonal test L(34) 来源 Ⅲ类方差和 自由度 均方 F值 显著性差异 萃取温度 0.403 2 0.201 16.323 0.002 萃取压力 0.594 2 0.297 24.073 0 萃取时间 0.297 2 0.148 12.035 0.004 夹带剂用量 1.846 2 0.923 74，853 0 重复 6.806×10° 6.806×10 0.006 0.943 误差 0.099 8 0.012 总和 64.116 18 修正总和 3.238 17 注：R²=0.970(校正R2=0.935)。 由L(34)正交分析表得：对提取率影响主次次序为：夹带剂用量>萃取压力>萃取温度>萃取时间。由方差分析表(表4)得：萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂用量的p值均小于0.01，差异极显著。生产最优工艺条件为： A2B2C3Di，即萃取温度为55℃、萃取压力200BAR、萃取时间为150min、夹带剂用量 0.35ml/min。黄酮类化合物的提取率为2.723%。而用传统的乙醇热回流法(萃取温度95℃、萃取时间5h、料液比为1：20，g/ml)提取橘皮中的总黄酮提取率为4.022%；超声波提取法为3.781%，参考方法见参考文献[16]。 3 结 论 在各项单因素试验对总黄酮提取率的影响中，夹带剂种类为甲醇，总黄酮提取率最高。 通过正交试验，各个参数对总黄酮提取率影响显著，主次次序为：夹带剂用量>萃取压力>萃取温度>萃 取时间。生产最优工艺条件为：萃取温度为55℃、萃取压力200BAR、萃取时间为150min、夹带剂用量0.35ml/min。黄酮类化合物的提取率为2.723%。与乙醇热回流法和超声波提取法相比，虽然总黄酮提取率相对较低，但是有机溶剂用量小，萃取时间短，工序简单，最大程度上节约了人力、物力和时间，在工业化生产方面有着广阔的前景。 ( 参考文献： ) ( [ 1 ] GUARDIATR A E . 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