注射液中多巴胺的含量检测方案(电化学工作站)

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(7)—968— 活化玻碳电极直接测定注射液多巴胺的含量” 王长芹，徐海红²，吴守国1** (1.中国科学技术大学化学系，合肥2300262.合肥市第三人民医院检验科，合肥230022) 摘要 自的：研究多巴胺(DA)在活化玻碳电极(AGCE)上的电化学行为，建立一种测定多巴胺(DA)的电化学分析方法。方法：玻碳电极在0.1mol·L-磷酸盐缓冲液(pH7.0)中活化，用循环伏安法研究 DA 在活化玻碳电极上的氧化还原特性，用微分脉冲伏安法直接测定 DA 的含量。结果：DA在活化玻碳电极上的循环伏安图具有一对灵敏的氧化还原峰，峰电位分别为0. 167 V 和0.217 V(us.SCE)。与裸玻碳电极相比，该电极对DA 的氧化具有良好的电催化作用。微分脉冲伏安法测定 DA 的氧化峰电流与其浓度在2个区间成正比，分别为1.0×10-6~2.5×10- mol·L和2.5×10-5~2.5×10- mol·L-1，线性相关系数分别为0.9931 和0.9938，检出限5.0×10mol·L-。抗血血酸(AA)和尿酸(UA)对DA的测定均没有干扰。结论：该方法操作简单方便，重现性较好，用于测定多巴胺注射液中 DA 的含量，结果令人满意。 关键词：活化玻碳电极；多巴胺；注射液；循环伏安法；微分脉冲伏安法 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2007)07-0968-05 Determination of dopamine content in injection with theactivated glassy carbon clectrode" WANG Chang -qin，XU Hai -hong，WU Shou - guo ** (1. Department of Chemistry，University of Science and Technology of China， Hefei 230026，China；2. Section of Chemical Examination， Hefei Third People's Hospital， Hefei 230022，China) AbstractObjective： To investigate the electrochemical behaviors of dopamine (DA) at the activated glassy carbonelectrode (AGCE) and establish a electroanalytical technique for the determination of DA. Methods：The glassy car-bon electrode was activated electrochemically in 0. 1 mol·L"phosphate buffer solution (pH 7.0).The redox char-acteristics of DA were investigated at the AGCE by cyclic voltammetry (CV).The dopamine content was determinedby differential pulse voltammetry(DPV). Results： A pair of sensitive redox peaks were observed at 0.167 V and0.217 V(us.SCE)，with the anodic and cathodic peak respectively，in 0.1 mol· Lphosphate buffer solution (pH7.0). Compared with the bare glassy carbon electrode (GCE)，the AGCE showed an excellent electrocatalytic activityfor the oxidation of DA. The anodic peak current was proportional to the concentration of DA in two sections，over therange of 1. 0×10-to 2.5×10-mol·L-and 2. 5×10-to 2.5×10-mol·L-respectively，and with the respec-tive correlation coefficients of 0.9931 and 0.9938. The detection limit was 5.0×10'mol·L-. The AGCE is easyto prepare with good reproducibility. Ascorbic acid (AA) and uric acid (UA) have no interference to the determi-nation of DA. Conclusion：The proposed method is simple， sensitive and reproducible and was applied to measurethe content of DA in injection with a good recovery. Key words：activated glassy carbon electrode；dopamine；injection；cyclic voltammetry；differential pulse voltammetry 多巴胺(dopamine，DA)是一种神经递质，是儿茶酚胺的一种，属于有刺激性的化学神经传递素1.21，它在中枢神经、肾脏、激素和心血管系统功能中起重要作用。在中枢神经系统的细胞液中， ( *国家自然科学基金资助项目(29975025) ) ( **通讯作者 T el：(0551)3606229；E -mail：sgwu@ustc. edu. cn ) 多巴胺的浓度非常低，大约在0.01~1 umol·L-114]。过量的多巴胺是许多疾病的征兆，例如，神经分裂症、帕金森病、艾滋病和癫痫病等15~8]。因此，对多巴胺浓度的定量分析在药物控制及临床诊 断等方面都具有非常重要意义。 多巴胺具有电化学活性，因此可以用电化学方法来测定。在实际的生物样品中，许多干扰物质的共存是用电化学方法测定多巴胺的主要问题。在这些物质当中，抗坏血酸是最显著的干扰物质，因为多巴胺和抗坏血酸的氧化电位非常接近，导致它们的伏安响应交迭。因此，在抗坏血酸共存的条件下，测定多巴胺成为电分析研究的主要问题。在这方面的研究，现在已经取得较大成绩，包括预处理和电极表面修饰，如激光活化，热处理10]，各种选择性膜11~13]，自组装修饰金电极[14-16]，酶修饰电极7，聚合物修饰电极[18-20]，碳纳米管修饰电极121~221等，这些修饰电极基本上都需要烦琐的预处理，而且电极的稳定性和重现性较差。 本文选择0.1 mol·L-的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)作为活性试剂，用循环伏安法在电位范围0.6~2.0V不环扫描15次来活化玻碳电极。与棵玻碳电极相比，活化电极对多巴胺的氧化具有良好的电催化作用，提高了测定多巴胺的灵敏度和线性范围。该电极制备简单，重现性较好，能在抗坏血酸、尿酸存在下测定多巴胺。用该活化电极测定注射液中的多巴胺，回收率和重现性较好。 1仪器与试剂 1.1 仪器 LK98B 型微机电学学分析系统(天津兰力科化学电子高技术有限公司)；三电极系统：玻碳电极(3mm)为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极；pHS -3C数字酸度计(杭州东星仪器设备厂)。 1.2 实验参数设置 实验方法选用循环伏安法、线性扫描伏安法和微分脉冲伏安法。循环伏安法和线性扫描伏安法：初始电位0.6V，终止电位-0.2V。微分脉冲伏安法：初始电位0.6V，终止电位-0.2V，电位增量0.005V，脉冲幅度0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲间隔0.2s。 1.3 试剂 多巴胺(Sigma)；尿酸(上海化学试剂公司)；抗坏血酸(上海化学试剂公司)；其他试剂均为分析纯0.1 mol·L-的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)作为底液，0.1 mol·L-KCl 作为支持电解质；实验用水为二次蒸馏水；实验前，缓冲溶液和样品溶液均通入氮气 5 min；所有实验在室温下进行。 2活化玻碳电极的制备2 玻碳电极的活化 将玻拓电极(GCE)在金相砂纸上抛光成镜面，用二次蒸馏水冲洗干净，然后依次在1：1硝酸、无水乙醇、二次蒸馏水中超声清洗5 min。置于0.1 mol·L-(pH7.0)的磷酸盐缓冲溶液中，用循环伏安法在电位0.6~2.0V范围循环扫描15次，取出，用二次蒸馏水冲洗干净即可用于测定。 2.2 电极活化条件的选择 对玻碳电极最优活化条件进行研究，最优条件的参数设定包括活化试剂、活化电位和活化时间。图1为2.0×10“mol·L-的DA(pH7.0磷酸盐缓冲溶液中)在裸电极(GCE)和不同活化剂活化的玻碳电电(AGCE)上的循环伏安图。活化试剂分别为0.5 mol·L-硫酸、1mol·L-氯化钠、1mol·L-醋酸钠、0.1 mol·L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)和1mol·L-'氢氧化钠。结果表明，经0.1 mol·L-磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)电化学活化处理的玻碳电极对DA的氧化峰电流有显著的增大作用，因此选择0.1 mol·L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)作为化化试剂。对活化电位和活化时间进行研究，结果表明，玻碳电极在0.6~2.0V范围以100mV·s循环扫描15次时，DA在活化电极上的峰电流最大。 图1 在0.1 mol· L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中DA(2.0×10-mol·L)在裸电极(1)和活化电极(2~5)上的循环伏安图 活化试剂分别为：1mol·L-氯化钠，0.5 mol·L-硫酸，1 mol ( ·L-氢氧化化和0.1mol·L-磷酸盐缓冲溶液(pH7.0) ) ( Fig 1 1 The cyclic voltammograms of DA(2.0×10 mol· L - )at GCE ) (1)and AGCE(2-5) in 0.1 mol·L- phosphate buffer solution(pH 7.0) with a scan rate 100 mV·s" ( The a ctivation solution from 2 to 5 is 1 mol·L-sodium chloride ) ( 0.5 mol·L - sulfuric acid，1 m ol· L - sod i um hydroxide and 0.1 mol·L- ph o sphate buffer solution ( p H 7. 0 ) res p ectively ) 3 多巴胺在活化玻碳电极上的电化学行为 3.1 多巴胺的循环伏安特性 图2是在0.1 mol· L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中DA(2.0×10-mol·L-)分别在裸电极和活化电极上的循环环伏图。由图2-b可见，DA在活化电极上有一对明显的氧化还原峰。当扫描速度为50mV·s时，还原峰和 氧化峰电位分别为0.217 V和0.167V。对比图2-a和图2-b可以看出，在活化电极上，DA的氧化峰电位负移，氧化峰电位和还原峰电位差从0.086V(a)降低到0.050 V(b)；同时，DA在活化电极上的氧化峰电流比在裸电极有显著提高。这表明，玻碳电极经过电化学活化后，对DA 的电化学反应有催化作用。因此，活化电极可以作为电化学反应的探针，提高电子转移速度。 图2在0.1 mol·L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中 DA (2.0×i0-mol·L-)在裸电极(a)和活化电极(b)上的循环伏安图 Fig 2 Cyclic voltammograms of 2.0×10-4 mol· L-DA at glassy car-bon electrode (a) and activated glassy carbon electrode (b)in 0. 1 mol·L- phosphate buffer solution( pH 7.0) with a scan rate 50 mV·s-1. 3.2 扫描速度对峰电流和峰电位的影响 研究了扫描速度对峰电流和峰电位的影响。如图3所示，扫描速度对峰电流和峰电位有很大影响。随扫描速度的增大，DA在活化电极上的氧化峰电位正移。当扫描速度在10~500mV·s范围时，氧化峰电流和还原峰电流与扫描速度v(mV·s)的平方根成正比。线性回归方程分别为： 将活化电极浸及2.0×10mol·L-' DA 溶液中10 min，取出用二次蒸馏水冲洗，然后放人空白溶液(0.1mol·L'，pH 7.0的磷酸盐缓冲液)中扫描，氧化峰电流和还原峰电流消失。表明，DA在活化玻碳电极上几乎不存在吸附现象，DA 在活化电极上的反应是扩散控制反应，因此，扩散在电极反应中起重要作用。 3.3 底液pH值的影响 研究了底液pH值(pH5.0~8.5)对DA电化学反应的影响，并对电极过程进行了探讨。图4为2.0×10 mol·L'的DA(0.1 mol· L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液)在AGCE 上的峰电流与底液 pH值的关系图。表明，随着 pH 值的增大，氧化峰电流 图3 在0.1 mol· L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中 DA (2.0×10-4mol·L-)在 AGCE 上在不同扫描速度(1~11)：10，20，50，100，150，200，250，300，350，400，500mV·s-下的循环伏安图 Fig3CCyclic voltammograms of 2.0×10-mol·L-D. at activatedelectrode in 0. 1 mol·L- phosphate hfier solutior( pH 7.0) with ascan ratc (1-11)：10，20，50，100，150，200，250，300，350，400，500mV·s-l， respectively 增大，当pH值达到7.0时，氧化峰电流达到最大值，此后随着 pH 值的增大，氧化峰电流开始减小；pH 值在6.8~7.5时，氧化峰电流变化不大，当pH大于7.5时，氧化峰电流快速降低。本实验选择0.1 mol· L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液作为支持电解质，因为在 pH 7.0，DA 的氧化峰电流最大且与生理环境 pH 值较为接近。研究了 pH 值对DA 在活化电极上伏安响应的影响：在pH 7.0左右，DA以阳离子形式存在；另一方面，由于电极在高氧化电位活化，电极表面含有的氧化功能基团增加。随pH值增大，氧化功能基团在 AGCE 上去质子化产生负电荷，DA 阳离子和电极之间发生静电吸引，使电子转移速度加快，氧化峰电流增大。但是，当pH 大于7.5时，DA阳离子浓度降低，与电极间的静电吸引能力降低，氧化峰电流降低。 此外，研究了底液pH值与DA氧化电位之间的关系。峰电位值Ea(mV)随溶液 pH 值的增大而呈线性降低，拟合的线性方程为： 上式表明有质子参与多巴胺的氧化过程。由于Ea-pH斜率为 -51.5mV·pH，说明反应过程中质子数和电子数相等。 4 电极活性与时间的关系 用循环伏安法研究了时间对电电活性的影响，选择氧化峰电流作为分析信号。在前2h，峰电流降低缓慢；此后，峰电流急速下降，直到活化后7 h；7 h以后，峰电流基本不变。在0.05~7 h之间，峰电流 图4 峰电流与pH的关系 Fig 4 Dependence of the anodic peak currents on the pH of solution I(pA)与时间t(h)成正比，线性回归方程为I=13.28-0.7732 t r=0.9948 24 h以后，峰电流仅为开始时的一半。因此，电极活化后，放置时间不宜太长。实验表明，进行50次测量后，电极就需要进行活化。 电极的重复性和重现性 表1为2.0×10mol·L的 DA在 AGCE上的重复性和重现性测定结果(底液为0.1 mol·L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液)，选择氧化峰作为分析信号。活化玻碳电极在同一份溶液中用循环伏安法连续测定10次，峰电位值变化为0.165V ~0.160V，峰电流的平均值为18.66 pA，最大相对误差是3.49%，RSD 为 2.71%，表明电极的重复性较好。用同一份 DA 溶液，玻电电极重复活化，每次活化后用循环伏安法测定，10次测定的结果见表1。峰电位值变化为0.165 V ~0.159V，峰电流的平均值为18.83 uA，最大相对误差是3.45% ，RSD 为2.48%，表明活化玻碳电极具有较好的重现性。 6 多巴胺的测定 为了得到较好的灵敏度，选择微分脉冲伏安法对 DA 进行定量测定。选择氧化峰电流作为分析信号。在实验条件下，DA的氧化峰电流Ia(pA)与其浓度 C(umol·L)在2个区间成正比，分别为1.0x10-6~2.5×10-mol·L-和2.5×10-5~2.5× 表1 重复性和重现性测定结果 Tab 1 Results for repeatability andreproducibility at AGCE 重复性(repeatability) 重现性(reproducibility) 序号 峰电位 峰电流 峰电位 峰电流 (peak potential) (peak current) (peak (peak (No.) /V /pA potential)/V current)/pA 0.165 19.001 0.164 19.117 2 0.165 19.268 0.162 18.187 3 0.164 19.207 0.164 19.229 4 0.164 19.088 0.163 19.153 5 0.163 18.416 0.162 18.902 6 0.163 19.027 0.162 18.521 7 0.162 18.468 0.16 18.993 8 0.16 18.061 0.160 18.286 9 0.161 18.096 0 159 18.434 10 0.160 18.012 0.165 19.480 10-mol·L-，线性回归方程分别为 I=3.57 +0.82C r=0.9931 检出限5.0×10mol·L。在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别对5.0×10-6，1.0×10-5，1.0×10-mol· L-'3个浓度的 DA 进行平行测定10次，RSD 和回收率列于表2，表明可以用于实际样品的定量分析。 7 干扰实验 在0.1 mol·L-，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，DA (2.0×10…mol·L-)和抗坏血酸(AA)(1.0x10-mol·L-)在活化玻电电极上的线性扫描伏安图的氧化峰电位分别为0.206V 和0.058V，两者的峰电位差为148mV。结果表明，AA 对 DA的测定没有干扰。可能的原因是，在 pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，AA主要以阴离子形式存在，与电极表面带负电荷的氧化功能基团之间发生静电排斥，阻碍了AA 在电极表面的电子交换反应。 表2 DA 定量分析的测定结果(n=10) Tab 2 Determination results of DA in injection 样品 浓度 测定值 RSD 加人值 测定值 回收率 ( concentration) (found)/ (added)/ (found)/ (recovery) (sample) /% /×10-5mol·L-1 x10-5mol·L-1 x10-5mol·L-1 x10-5mol·L-1 /% 1 0.50 0.51 2.70 0.10 0.104 104 2 1.00 0.98 1.57 1.00 1.01 101 3 10.00 9.94 2.30 2.00 1.96 98.0 在0.1 mol·L-'， pH 7. 0的磷酸盐缓冲液中DA(2.0×10- mol·L-')和尿酸(UA)(1.0 x10-mol·L-)在活化玻碳电极上的线性扫描伏安图的氧化峰电位分别为0.198V和0.329V，两者的峰电位差为131mV。结果表明，UA 对DA 的测定没有干扰。可能的原因是，在 pH 7.0 的磷酸盐缓冲液中，UA 阴离子与电极表面带负电荷的氧化功能基团之间发生静电排排，使得UA 的氧化电位向负方向移动。 8 分析应用 在最佳实验条件下，用活化玻碳电极来测定多巴胺注射液中多巴胺的含量。用微分脉冲伏安法来测定，用标准工作曲线计算其浓度，测定结果列于表3，可见本法所得结果与药典法测定结果相符合。因此，本方法可以用于测定注射液中 DA 的含量。 表3 注射液中DA 含量的测定结果(n=10) Tab 3 Determination rerults of DA in injection 品 标示量 本法测定 RSD 吸收光谱法 (marked content) (tris method) (spectrophotometry)[23] /% (sample) /mg·mL- /mg·mL- /mgmL-1 10 10.18 2.30 9.96 2 10 9.97 1.86 9.98 3 10 10.12 1.32 10.17 9 结论 研究结果表明，活化玻碳电极对多巴胺的电化学氧化具有明显的催化作用，能显著增大多巴胺的氧化电流，提高多巴胺分析测定的灵敏度。玻碳电极通过在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中循环扫描进行活化，操作简单，重现性较好。在活化的玻碳电极上，AA和UA对DA的测定均没有干扰。该法用于测定注射液中DA 的含量，分析结果令人满意。 ( 参考文献 ) ( 1 Wightman R M ， May L J， Michael A C. 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