桂附地黄丸中乌头碱检测方案(毛细管电泳仪)

中国中药杂志China Journal of Chinese Materia MedicaVol.33， Issue 14July，2008第33卷第14期2008年7月 桂附地黄丸中痕量毒性成分乌头碱的限量检测 李珺沫，蒋 晔* (河北医科大学药学院，河北石家庄050017) [摘要] 目的：建立毛细管电泳场放大富集技术检测桂附地黄丸中痕量毒性成分乌头碱的方法。方法：采用未涂层熔融石英毛细管柱(50 pm x43 cm，有效长度35 cm)为分离通道，50 mmol·L-磷酸二氢钠(pH4.6)-甲醇(8：2)为运行缓冲溶液；运行电压10 kV；进样电压10 kV，进样时间 40 s；在进样之前设定用甲醇冲洗，压力3.5kPa，冲洗时间 5s；检测波长235 nm。结果：该法使乌头碱的检测灵敏度提高了500倍乌头碱在31.3~2×10ug·L"呈良好的线性关系(r=0.9996)，最低检测限为9.4gL，平均回收率为98.0%，RSD 2.6%。结论：本方法简便、快速、专属性强、富集效率高，为桂附地黄丸的生产及质量控制提供了一种新的、可靠的分析手段。 [关键词] 毛细管电泳场放大富集技术；附桂地黄丸；乌头碱；限量检测 [中图分类号]R 284.1 [文献标识码]A[文章编号]1001-5302(2008)14-1684-04 桂附地黄丸为传统中药制剂，由肉桂、附子、熟地黄、山茱萸等8味中药组成，具有温补肾阳的作用，临床上主要用于治疗腰膝酸软，肢冷尿频。方中附子含有痕量成分乌头碱，现代药理研究证实其具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗肿瘤、降血压等作用。但乌头碱的毒性很强，人口服乌头碱0.2 mg 即可出现恶心、呕吐、头晕、眼花、脉缓、乎吸困难、神志不清、心律紊乱等中毒现象。然而，由于目前附子没有统一的炮制方法，因此，为控制药品质量，保证用药安全，有必要对桂附地黄丸中痕量毒性成分乌头碱进行质量控制。 目前乌头碱的限量检查主要采用分光光度法、薄层色谱法3-41和高效液相色谱法[5-7]等。分光光度法测定的是药材或制剂中总生物碱的含量，选择性差，达不到对乌头碱限量控制的要求。薄层色谱法样品预处理繁琐费时，并且由于乌头碱的含量较低，共存组分干扰较大而导致特异性差，误差大，定量分析不够准确。由于中药制剂成分复杂，高效液相色谱法对于结构相近的碱性物质的分离难度较大”，因此对样品的预处理及柱效要求较高。作者建立毛细管电泳(CE)场放大富集技术检测桂附地黄丸中的痕量乌头碱。该方法将 CE 分离度高、 ( [收稿日期] 2007-10-24 ) ( [通讯作者] 蒋晔， Tel：(0311)86266069，E-mail： jiangye@ hebmu. edu.cn ) 选择性好、样品用量少等优点与场放大富集技术适应痕量分析的要求相结合，大大提高了定量分析中的专属性和灵敏度，为桂附地黄丸生产过程中的质量控制及防止药物中毒提供了一种新的、可靠的、方便实用的分析手段。 1仪器与试药 高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司，中国科学院研究生院应用化学所)，高压电源(北京彩陆科学仪器有限公司，中国科学院研究生院应用化学所)，紫外检测器(北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究生院应用化学所)，未涂层熔融石英英细管柱(50 um ×43 cm，35 cm)(河北永年光导纤维厂)。乌头碱对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号0720-9807)；盐酸丁卡因由北京制药厂生产；桂附地黄丸由河南省宛西制药有限公司生产(批号030602，030603，050801)。甲醇为色谱纯，所有其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。 2方法与结果 2.1 电泳条件 运行缓冲溶液为50 mmol· L磷酸二氢钠(pH4.6)-甲醇(8：2)；运行电压10 kV；进样电压10kV，进样时间40 s；在进样之前设定用甲醇冲洗，压力为3.5 kPa，冲洗时间5s；温度25℃；紫外检测波长235 nm。开机后毛细管柱用0.1 mol·L氢氧化钠溶液冲洗10 min，水冲洗10 min，运行缓冲溶液冲洗 10 min，每次进样后用0.1 mol·L-氢氧化钠溶液、水和运行缓冲溶液分别冲洗3 min。所有溶液在使用前均用0.45 p.m纤维树脂膜滤过。 2.2 溶液制备 2.2.1 内标溶液制备 精密称取盐酸丁卡因20.0mg 置100 mL量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标储备液，再以甲醇稀释得浓度为200 pg·L的内标溶液。 2.2.2 对照品溶液制备 精密称取乌头碱对照品20.0 mg 置100 mL量瓶中，加内标溶液使其溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。 2.2.3 供试品溶液制备 取本品，研细，取粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加1 mol·L盐酸10 mL，冰浴超声处理 40 min，滤过，取续滤液5mL，置分液漏斗中，用乙醚洗涤3次，每次10 mL，弃去乙醚液，将酸水层用氨水调pH9~10，再用乙醚提取3次，每次10 ml..，收集乙醚层，挥干，残渣用内标溶液溶解，置10 ml量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 2.3 分离方法考察 2.3.1 系统适用性试验 在2.1项电泳条件下，乌头碱对照品和供试品溶液色谱图分别见图1。由图可见，内标及桂附地黄丸中其他药材对乌头碱的测定不产生干扰，理论塔板数以乌头碱计不低于1万。 A.对照品；B.供试品；1.内标；2.乌头碱 图1 乌头碱 CE 图 2.3.2 线性关系考察 精密吸取乌头碱对照品储备液1mL 置100 mL量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为1号工作液，再从1号工作液中吸取5 mL 置10 mL量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，得2号工作液，依此法对倍稀释得3，4，5，6，7号系列标准溶液，质量浓度分别为2×10，1×10，500，250，125，62.5，31.3 ug·L。按2.1项下电泳条件进样，记录色谱峰面积，以对照品与内标物峰面积比值Y对质量浓度X(ug·L)进行线性回归，得线性方程Y=4.7×10-3X+0.1，r=0.999 6。 结果表明乌头碱在31.3~2×10ug·L线性关系良好。 2.3.3 最低检出限测定 取乌头碱线性标准溶液稀释，进样并记录电泳图，按 S/N=3计，乌头碱最低检测限为9.4pg·L。 2.3.4 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样分析5次，记录峰面积，结果乌头碱与内标物峰面积比值 RSD 2.3%。 2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液在相同电泳条件下分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，记录色谱峰面积，乌头碱与内标物峰面积比值 RSD3.6%，结果表明供试品溶液在24h 内稳定。 2.3.6 重复性试验取同一批(批号030602)样品5份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱峰面积，结果乌头碱与内标物峰面积比值 RSD 2.3%。 2.3.7 加样回收试验 取同一批(批号030602)桂附地黄丸粉末，加入乌头碱对照品的甲醇溶液适量，挥干，按供试品溶液制备项下方法操作，并按2.1项下电泳条件进样，测定乌头碱的含量，计算加样回收率及 RSD，测定结果见表1。 表1 乌头碱加样回收率(n=3) 样品中量 加入量 测得量 回收率 平均值 RSD /ng /ng /ng /% /% /% 2388 3000 5418 101.0 98.9 3.1 2402 3000 5441 101.3 2404 3000 5 263 95.3 2401 2500 4801 96.0 98.0 2.3 2393 2500 4833 97.6 2405 2500 4915 100.4 2401 2 000 4391 99.5 97.2 2.3 2400 2000 4340 97.0 2390 2000 4290 95.0 2.3.8 样品含量测定取3批供共品溶液，按2.1项下电泳条件进样，计算乌头碱的含量，结果批号030602，030603，050801的3批桂附地黄丸中乌头碱的质量分数分别为0.0080%，0.008 5%，0.005 4%。 3 讨论 3.1 CE 条件的优化 3.1.1 缓冲溶液 pH的影响 pH对分离度和迁移时间具有显著影响。本试验对 pH4.0~6.0 进行了考察。结果表明：随着pH增加，电渗流增强，保留时间继而缩短，而分离度随着pH增加逐渐变小。因此综合以上两方面因素，选择pH4.6。 3.1.2 缓冲溶液浓度的影响 离子强度(浓度)主要影响双电层厚度，离子强度越大双电层越薄，电渗降低；同时浓度越大电流越大，其产生的焦耳热也越大，基线噪声提高。本试验考察了缓冲溶液在40~70 mmol·L-对乌头碱迁移行为及峰形的影响。结果表明：随着缓冲溶液浓度的增大，乌头碱的迁移时间变化不大，但电流随之增大，基线不平，噪音增加，峰形变差，故选择50 mmol·L的磷酸二氢钠作为缓冲溶液。 3.1.3 有机添加剂的影响 有机添加剂主要影响组分的分离选择性和柱效，同时有机添加剂比例增加，迁移时间随之增加。本试验考察了甲醇比例在10%~40%对乌头碱分离度及迁移行为的影响。结果表明：随着甲醇比例的增加，乌头碱的分离选择性增加，当甲醇比例为20%时，乌头碱与内标及样品中其他组分达到良好分离。继续增加甲醇比例，分离度提高不明显而迁移时间显著增加，故选择甲醇比例为20%。 3.2 富集条件的优化 3.2.1 预进溶液对富集效果的影响 在样品电动进样之前注入一段低电导的溶液塞可以提高富集效果。这是因为施加电压后，低电导的溶液塞所在区带的电场很强，在电动进样时，被分析离子会快速迁移通过低电导的溶液塞，达到分离电解质的界面时因电场强度的显著降低而快速地降低迁移速率，从而使分析物离子在分离前得到有效富集。本试验分别考察了预进水、乙腈和甲醇对富集效果的影响。结果表明在2.1项电泳条件下，预进水乙腈和甲醇时，与常规电迁移进样相比，检测灵敏度分别提高100，80 和500倍。故选择甲醇为预进溶液。 3.2.2 进样时间对富集效果的影响向 进样时间的长短主要影响进样量的大小，从而影响富集效果。本试验考察了进样时间在20~60s对富集效果的影响。结果表明：随着进样时间的增加，峰高明显增加，在40s之前无减缓趋势，乌头碱与内标及桂附地黄丸中其他组分分离良好，继续增加进样时间，峰高不再增加，峰展宽明显，柱效降低，而不利于定量 测定，故选择进样时间为 40 s。 3.2.3 运行电压对富集效果的影响 在其他试验条件不变的情况下，本试验考察了运行电压在8 ~12kV对富集效果的影响。结果表明：峰高随运行电压的增加而增高，但是随着运行电压的增大，组分保留时间减小且乌头碱峰与内标和样品中其他组分峰分离度减小，不利于分离测定。当运行电压为10kV时，乌头碱峰峰形良好，各组分均完全分开，故选择最佳运行电压为10 kV。 3.3 提取条件的选择 乌头碱的提取常采用冷浸法”和超声提取法，但提取的效果不尽相同。由于乌头碱为亲脂性生物碱，并且对热很不稳定，因此作者利用生物碱的碱性，加酸冰浴超声超取 40 min 使生成盐溶于水，加乙醚萃取去除脂溶性杂质，再碱化，用乙醚萃取，去除水溶性杂质。该法效果良好，使待测组分处无干扰。同时采用冰浴超声提取既防止成分遇热分解又大大提高了提取效率。 提取过程中加氨水碱化时 pH 应控制在9~10，pH<9，则生物碱游离不完全，pH>10，用乙醚萃取时易产生乳化，乌头碱易被破坏。 样品提取过程中，应注意操作要迅速，如果提取时间过长，则乌头碱水解，将影响测定结果。 ( [参考文献] ) ( [1] 符华林.我国乌头属药用植物的研究概况[J].中药材，2004， 27(2)：149. ) ( [2] 姚志凌，李明辉.分光光度法测定风湿定胶囊中乌头碱含量[J].中国药业，2007，16(5)：22. ) ( [3] 孙玲，戚 敏，钟华风.桂附地黄丸中乌头碱限量检查方法 研究[J].齐鲁药事，2004，23(5)：27. ) ( [4] 张晓宏，周 引 莉，杨龙辉，等.血宝胶囊的薄层色谱鉴别及乌头碱的限量控制[J].华西药学杂志，2001，16(6)：451. ) ( [5]刘 刚，王 辉，周本宏.高效液相色谱法测定思康达胶囊中 乌头碱的含量[J].医药导报，2005，24(12)：1170. ) ( [6] Wang Z H， Wen J， Xing JB， et a l. 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A good linear relationwas obtained in the range of 31.3-2×10'pg·L"'(r=0.999 6)， with the detection lin it of 9.4g. The average recovery was98.0% with the RSD of 2. 6%. Conclusion： The method is simple， rapid and specific with high stacking efficiency； it provides a newreliable means for production and quality control of Guifudihuang pills. [Key words] Field-amplified sampk.stacking capillary electruphoresis； Guifudihuang pills； aconitine alkaloid； limited deter-mination [责任编辑 鲍 雷] 利用流体动力式超声提取中药的实验研究 王 地*，关 怀，邹海艳，于 萍，徐 扬²，张红月 (1.首都医科大学中医药学院，北京100069； 2.北京光慧晓明声能技术研究所，北京100083) [摘要] 目的： 研究利用流体动力式超声提取中药的方法。方法：以黄芩苷含量为指标，利用高效液相色谱法测定黄芩苷含量，以煎煮、回流、槽式超声等方法作对照，研究利用流体动力式超声提取黄芩苷的方法；以总黄酮含量为指标，利用高效液相色谱法测定黄酮含量，槽式超声和回流等方法作对照，研究用流体动力式超声提取银杏叶的方法，以浸出物含量为指标，煎煮法作对比，用流体声能提取中药复方。结果：利用流体动力式超声提取黄芩苷含量显著高于其他方法，流体动力式超声提取银杏叶总黄酮含量与槽式超声无显著差异。用流体动力式超声提取中药复方的浸出物含量显著高于煎煮法。结论：流体动力式超声可提高黄芩苷的提取效率，提取银杏叶总黄酮含量与槽式超声相当并有利于中药复方中水溶性成成的溶出。 [关键词] 流体动力式超声；提取工艺；高效液相色谱法 [中图分类类] R283 [文献标识码] A [文章编号]1001-5302(2008)14-1687-04 近年来，在中药提取中，超声波以其节能、快速、温度低等优点受到重视。超声波作用于液体时所产生的空化效应以及热效应和机械效应，使其可缩短 ( [收稿日期] 2008-03-14 ) ( [基金项目] 国家自然科学基金项目(30672605) ) ( [通讯作者] 王地，Tel：(010)83911628，Fax：(010)83911627， E-mail：wangdi20022008@tom. com ) 植物药提取时间，提高提取率。流体动力式超声是由流体动力式超声发生器产生的混合频率的声能。流体动力式超声发生器与目前常用的压电式超声发生器一样，是功率超声的一种，其特点是以高速流动的气体或液体为振动能量的来源而产生超声，根据动力来源分为气哨和液哨2种，频率通常在20~30kHz。该设备具有节能、温度低、处理量大、 。◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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