骨筋丸胶囊中士的宁和马钱子碱检测方案(毛细管电泳仪)

第32卷第3期2009年3月Vo1 32 No)33 Mar2009北京中医药大学学报Joumal of Beijing University of Traditional Chinese Medic ine·194· ·195·第3期李2 等 骨筋丸胶囊中毒性成分士的宁和马钱子碱的在线富集检测 ·中药化学· 骨筋丸胶囊中毒性成分士的宁和马钱子碱的在线富集检测 李2 蒋 晔# (河北医科大学药学院 河北050017) 摘要：目的 建立毛细管电泳场放大富集技术同时检测骨筋丸胶囊中有效毒性成分士的宁和马钱子碱的方法。方法 选择未涂渍弹性石英毛细管(50 um X57 cm，有效分离长度50cm)为分离通道，20 mmol/L醋酸钠(醋酸调 pH 3.8)为运行缓冲溶液；运行电压20kV；进样电压 20 kV，进样时间25s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5 kPa，冲洗时间3s；紫外检测波长260 mm。结果 该方法使士的宁和马钱子碱的检测灵敏度分别提高了600倍和400倍。士的宁在14.8~940. 0 ug/L浓度范围内线性关系良好(r=0. 999 8)，最低检测限为1.48 pg/L，平均回收率为98.5%，RSD 为1. 9%；马钱子碱在17.2~1090.0ug/L浓度范围内线性关系良好(r=0. 999 9)，最低检测限为2.58ug/L，平均回收率为98.5%，RSD 为1.8%。结论 本方法简便、快速、富集效率高，为骨筋丸胶囊生产过程中的质量控制及临床药物监测提供了一种新的、可靠的分析手段。 关键词：毛细管电泳场放大富集技术；骨筋丸胶囊；士的宁；马钱子碱 中图分类号：R284. 1 On-line enrichm ent detection of strychn ine and bruc ine-toxic com positionin Gujinwan Capsules LIJunmei， JIANG Ye (School of Phamacology， HebeiMedicalUniversity， Hebei 050017) Abstract：ObjectiveTo set up a method of field-amplified sample stacking in capillary electrophoresis for detecting simultaneously strychnine and brucine-effective toxic composition in Gujinwan Cap sulesM ethods The uncoated fused-silica cap illary column (50 um X57 cm， with effective length of 50 cm)was cho sen as separation channel1TThe running buffer was 20 mmol/L sodium acetate (pH 3. 8)，running voltage was 20 kV， injection voltage was 20 kV and injection time was 25 seconds The samp lewas flushed with hydraulic pressure of3. 5 kPa and for 3 seconds before electrokinetic injection TTheultraviolet detection wavelength was 260 nm. ResultsThe detection sensitivities of strychnine and brucinewere increased by 600 and 400 times respectively with this method SStrychnine showed a good linearrelationship at range of 14. 8pg~940. 0 ug/L (r=0. 999 8) with the lim it of detection of 1. 48 ug/Land average recovery of 98. 5%(RSD=1. 9%). B rucine showed a good linear relationship at range of17. 2 ug~1090. 0 pg/L (r=0. 999 9) with the lm it of detection of2. 58 ug/L and average recovery of98.5%(RSD =1. 8%). Conclusion The method is simple and convenient with higher enrichmentefficiency， which is a new and reliable analysis for the quality control and clinicalmonitoring of GujinwanCap sules Key words： field-amp lified sample stacking in capillary electrophoresis； Gujinwan Cap sules； strychnine；brucine ( 李2 ，女，在读硕士生 ) ( #通讯作者：蒋 晔，男，博士，教授，硕士生导师 ) 骨筋丸胶囊是由马钱子(制)、乳香、没药等14味中药制成的中药制剂，具有活血化瘀、舒筋通络、祛风止痛之功效，临床上常用于治疗肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎和大骨节病等。方中马钱子中的主要活性成分为士的宁和马钱子碱，它们具有散结消肿、通络止痛的功效，然而，由于其有效剂量与中毒剂量非常接近，容易发生中毒。同时，虽然我国药典对马钱子的炮制有统一的规定，但实际上马钱子因为产地和炮制程度的不同，士的宁和马钱子碱的含量亦有很大差异，即使加工成中成药应用，使用者还时有毒副反应发生2。因此，为控制药品质量，保证用药安全，有必要对骨筋丸胶囊中有效毒性成分士的宁和马钱子碱进行限量检测。目前，士的宁和马钱子碱的检测主要采用分光光度法13-41薄层扫描法51、高效液相色谱法16-8]和毛细管区带电泳法(CZE))等，然而其检测灵敏度较低，因此，本文建立毛细管电泳(CE)场放大富集技术同时检测骨筋丸胶囊中有效毒性成分士的宁和马钱子碱的方法。 仪器与试药 高效毛细管电泳仪、高压电源、紫外检测器(均为北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究生院应用化学所)，未涂渍弹性石英毛细管(50 um X57 cm，有效分离长度 50cm)(河北永年光导纤维厂)。 士的宁和马钱子碱对照品均由中国药品生物制品检定所提供(批号分别为110705-200306和110706-200505)；骨筋丸胶囊由哈尔滨泰华药业股份有限公司生产(批号20070901，20070903，20071005)。甲醇为色谱纯，所有其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。 2方法与结果 2.1 电泳条件 未涂渍弹性石英毛细管，50 um X57 cm，有效分离长度50cm；运行缓冲溶液为20mmol/L醋酸钠(醋酸调 pH3.8)；运行电压 20kV；进样电压20kV，进样时间25s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5kPa，冲洗时间3s；紫外检测波长260 mm。每次开机后毛细管柱依次用0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水和运行缓冲溶液分别冲洗10min；每次进样后用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水和运行缓冲溶液分别冲洗 3min。所有溶液在使用前均用0.45um纤维树脂膜滤过。 2.2对照品溶液的制备 精密称取士的宁对照品适量，置100mL量瓶中，用20%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成 质量浓度为75.2mg/L的士的宁对照品储备液。 精密称取马钱子碱对照品适量，置100mL量瓶中，用20%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为87.2mg/L的马钱子碱对照品储备液。 分别精密量取士的宁对照品储备液 2.5mL马钱子碱对照品储备液2.5mL，置100mL量瓶中，用20%的甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成含士的宁和马钱子碱质量浓度分别为1.88mg/L和 218mg/L的混合对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备 取本品20粒，倾去内容物，精密称定，取相当于平均胶囊重的样品量(约0.3g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨水 1mL，使润湿5min，加入氯仿15 mL，浸泡 30min，超声处理 60 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液 0.5mL，置 10 mL量瓶中，加甲醇 1.5mL，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45um纤维树脂膜滤过，作为供试品溶液。 24 毛细管电泳条件的优化 24.4.11缓冲溶液 pH值的影响 缓冲溶液的 pH值强烈影响弹性石英毛细管内表面的特性，改变电渗流的大小，从而影响迁移时间和分离度。本试验考察了 pH在3.5~7.0范围内对士的宁和马钱子碱迁移时间和分离的影响，结果见图1. 图1 缓冲溶液 pH的影响 由图1可知，随着 pH值的增加，电渗流增强，迁移时间继而缩短，但分离度逐渐降低，当pH=3.8时，迁移时间适中且分离度最大，故选择 pH值为3.8。 2.4.2 缓冲溶液浓度的影响 缓冲溶液的浓度对迁移时间和分离度的影响也较为明显，增加缓冲溶液的浓度，可以降低电渗流，改善分离度。本试验考察了缓冲溶液在 10~30 mmol/L浓度范围内，对士的宁和马钱子碱迁移行为及分离的影响，结果见图2. 图2 缓冲溶液浓度的影响 由图2可知，随着缓冲溶液浓度的增加，士的宁和马钱子碱的迁移时间逐渐增大，当缓冲溶液的浓度为20 mmo1/L时，士的宁和马钱子碱达到基线分离，继续增加缓冲溶液的浓度，迁移时间延长且基线噪声提高，故选择20 mmol/L的醋酸钠作为缓冲溶液。 2.5 富集条件的优化 2. 5. 1 预进溶液对富集效果的影响 在样品电动进样之前注入一段低电导的溶液塞可以提高富集效果。这是因为施加电压后，低电导的溶液塞所在区带的电场很强，在电动进样时，被分析离子会快速迁移通过低电导的溶液塞，达到分离电解质的界面时因电场强度的显著降低而快速地降低迁移速率，从而使分析物离子在分离前得到有效富集。本试验分别考察了预进水和乙腈对富集效果的影响。结果表明：在“2.1”项电泳条件下，预进溶液为水时，与常规电迁移进样相比，士的宁和马钱子碱的检测灵敏度分别提高600和400倍，而预进溶液为乙腈时对士的宁和马钱子碱的富集效率不高，故选择水为预进溶液。 2.5.2 进样时间对富集效果的影响 进样时间的长短主要影响进样量的大小，从而影响富集效果与柱效。本试验考察了进样时间在15~35s范围内，对富集效果的影响。结果表明：随着进样时间的增加，峰高明显增加，在25s之前无减缓趋势，继续增加进样时间，峰高增加不明显，峰展宽显著增加，柱效降低，而不利于定量测定，故选择进样时间为25s. 2.5.3 运行电压的影响 在其他试验条件不变的情况下，本试验考察了运行电压在10~30kV范围内，对富集效果的影响，结果见图3. 由图3可知，峰高随运行电压的增加而增高，但是随着运行电压的增大，组分迁移时间缩短，而士的宁与马钱子碱的分离度减小，不利于分离测定。当 35 图3 运行电压的影响 运行电压为20kV时，士的宁与马钱子碱的分离度和峰形良好，故选择最佳运行电压为20 kV。 26 提取条件的选择 试验中分别采用碱性甲醇和碱性氯仿作为提取溶剂，当用碱性甲醇提取时，提取的成分较多，电泳分离较差。改用碱性氯仿为提取溶剂，提取成分较少，杂质干扰少，电泳分离好。比较超声、冷浸、回流等提取方法，表明用冷浸加超声的提取方法用时短，且提取效果较为理想。 2.7 系统适用性试验 按“2.1项下电泳条件进样分析，对照品溶液和供试品溶液的色谱图，见图4(A、B)，骨筋丸胶囊中其他药材对士的宁和马钱子碱的测定不产生干扰，理论塔板数以士的宁计不低于50000，以马钱子碱计不低于70000。 A对照品 B供试品 1士的宁 2马钱子碱 图4 对照品及供试品毛细管电泳图 2.8 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液 5mL，置10mL量瓶中，用20%的甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成含士的宁和马钱子碱质量浓度分别为940 ug/L和 1090 ug/L的混合对照品溶液，作为线性1号工作液。精密量取1号工作液5mL置 10mL量瓶中，用20%的甲醇稀 释至刻度，摇匀，配制成2号工作液，依次采用倍比稀释法配制3~7号工作液。按“21"项下电泳条件进样，记录色谱峰面积，以对照品浓度 C(ug/L)为横坐标，相应的峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，士的宁和马钱子碱分别在14.8~940.0ug/L和17.2~1090.0ug/L范围内线性关系良好，r均大于0.999 8.结果见表 1。 表1 士的宁和马钱子碱的线性关系 成分 线性方程 r线性范围/(ug/L) 士的宁 4=141×0C-786X0 09998 148~9400 马钱子碱 4=119×0C-928×0 09999 17.2~10900 2.9 最低检测限 取线性标准溶液继续稀释，进样并记录电泳图，按信噪比(S/N)=3计，士的宁的最低检测限为1.48 pg/L，马钱子碱的最低检测限为2.58pg/L。 2.10 精密度试验 按“2.1”项下电泳条件，取同一混合对照品溶液连续进样5次，士的宁和马钱子碱峰面积的 RSD 分别为1.9%和2.2%。 211 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，士的宁和马钱子碱含量的 RSD分别为2.1%和23%，表明供试品溶液在24h内稳定。 212 重复性试验 取同一批(批号20070901)样品5份，按‘“2.3”项下方法配制供试品溶液，进样测定，记录电泳图，以各成分峰面积计算含量，取平均值，所得结果：士的宁0.0203%马钱子碱 0.0132%；以各成分含量计算 RSD，所得结果士的宁2.0%马钱子碱1.8%，表明重复性良好。 213 加样回收率试验 取已知士的宁和马钱子碱含量的骨筋丸胶囊样品(批号20070901)粉末，精密加入士的宁和马钱子碱对照品溶液适量，挥干，按“23"项下方法操作，并按“21"项下电泳条件进样，测定士的宁和马钱子碱的含量，计算加样回收率及RSD，测定结果见表2. 表2 士的宁和马钱子碱加样回收率测定结果(n=3) 化合物 样品称样量/mg 样品中含量/ug 加入量/pg 测得总量/pg 回收率/% 平均值/% RSD/% 士的宁 301.1 61.6 60.2 119.7 96.5 299.5 61.3 60.2 120.4 98.2 98.0 1.4 303.0 620 60.2 121.8 99.3 300.2 61.4 75.2 136.1 99.3 301.7 61.7 75.2 137.5 100.8 98.8 23 305.3 625 75.2 1349 96.3 301.9 61.8 90.2 152.9 101.0 301.5 61.7 90.2 150.4 98.3 98.8 20 302.0 61.8 90.2 149.4 97.1 马钱子碱 301.1 40.3 34.9 741 96.8 299.5 40.1 34.9 75.1 100.3 98.4 1.8 303.0 40.6 34.9 74.8 98.0 300.2 40.2 43.6 82.6 97.2 301.7 40.4 43.6 84.5 101.1 98.9 20 305.3 40.9 43.6 83.8 98.4 301.9 40.5 52.3 923 99.0 301.5 40.4 52.3 922 99.0 98.1 1.5 302.0 40.5 52.3 90.9 96.4 2.14 含量测定 取3批骨筋丸胶囊样品，按“2.3"项下配制供试品溶液，按““2.1"项下电泳条件进样，记录电泳图，计算士的宁和马钱子碱的含量，结果见表3. 表 3 骨筋丸胶囊中士的宁和马钱子碱的含量测定结果(%；n=3) 批号 士的宁 马钱子碱 含量 RSD 含量 RSD 20070901 0.0203 2.0 0.0133 1.9 20070903 0.0267 1.8 0.0250 1.8 20071005 0.0180 2.3 0.0170 24 3讨论 目前，士的宁和马钱子碱的检测主要采用分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和毛细管区带电泳法(CZE)等。分光光度法测定的是药材或制剂中总生物碱的含量，该方法选择性差，达不到对士的宁和马钱子碱限量控制的要求。薄层色谱法样品预处理繁琐费时，并且由于二者的含量较低，共存组分干扰较大而导致特异性差，重现性差，误差大，定量分析不够准确。中药制剂成分复杂，并且马钱子中的多种生物碱结构相似，性质相近，高效液相色谱法对于结构相近的碱性物质的分离难度较大，因此对样品的预处理及柱效要求较高。由于骨筋丸胶囊中士的宁和马钱子碱的含量较低，采用常规的 CZE因其检测灵敏度较低而导致无法检测。因此，本文建立毛细管电泳(CE)场放大富集技术同时检测骨筋丸胶囊中有效毒性成分士的宁和马钱子碱的方法。该方法将CE分离效率高、样品用量少、环境污染小等优点与场放大富集技术选择性好及适应痕量分析的要求相结合，大大提高了定量分析中的专属性和灵敏度。士的宁和马钱子碱的检测灵敏度与常规CZE进样相比分别提高600倍和400倍，达到文献报道的高效液相色谱法的水平且有较高的分离能力。该方法的建立为骨筋丸胶囊中毒性成分士的宁和马钱子碱的限量检测提供了一种新的、可靠的、方便实用的分析手段。 (上接第193页) 的一个主要方面。NK细胞在肿瘤免疫中起重要作用，可以杀伤并溶解体内的肿瘤细胞，是机体免疫应答的第一道防线。T细胞为细胞免疫的主要方面，是机体抗肿瘤免疫的核心力量，T淋巴细胞增殖反应率是一个能够代表机体免疫能力的重要免疫因素 。本实验发现，荷瘤小鼠应用 ADM后 T淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性均下降，而 ADM联合六君子汤治疗后，二者均有所升高，提示六君子汤可对抗化疗药物 ADM所致的免疫抑制，促进机体免疫功能的恢复，从而可提高机体的抗肿瘤作用。 总之，本研究表明六君子汤与阿霉素合用具有增敏阿霉素抗肿瘤作用的效果并可以减轻阿霉素的心脏毒性，提高机体免疫力。这为六君子汤在肿瘤化疗中的应用提供了一定实验依据。 ( 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