蔬菜中有机磷检测方案(气质联用仪)

蔬菜水果中有机磷农药残留的GC-NCI-MS分析及其基体效应影响 林竹光1 范玉兰1 马 玉 金 珍1 谭 君 陈美瑜 陈招斌1 涂逢樟² 刘 勇 (1.厦门大学化学化工学院化学系，现代分析科学教育部重点实验室，福建厦门361005； 2.龙岩学院化学与材料工程系，福建龙岩 364000；3.广州市疾病预防控制中心，广州 510080) 摘要 将气相色谱-负化学离子源-质谱法(GC-NCI-MS)应用于蔬菜水果中九种有机磷农药残留的分析，初步解析了这些农药的NCI-MS 阴离子结构和断裂机理，并且初步探讨了GC-NCI-MS法分析蔬菜水果中有机磷农药残留时基体效应的影响问题，采用空白试样基体匹配校准曲线(MC)法定量分析，有效地降低了试样基体效应的影响。蔬菜水果试样用乙酸乙酯超声提取，以乙硫磷为内标物，采用GC-NCI-MS的选择离子监测方式(SIM)进行定性和定量分析。九种有机磷农药的方法检测限为0.12~1.0cg·kg，在方法检测限与1000 g·kg浓度范围内，线性相关系数都大于0.9993。当空白蔬菜水果试样的加标浓度水平为100、400、800 g·kg时，平均加标回收率为78%~126%，相对标准偏差为0.58%~14.7%。 关键词司(GC-NCI-MS、有机磷农药、农药残留、基体效应。 蔬菜水果中有机磷农药残留的分析通常采用气相色谱-火焰光度检测法(GC-FPD)[1.2]、气相色谱-普磷检测法(GC-NPD)B和气相色谱-质谱(GC-MS)法[4~5]。气相色谱-电子轰击电离源-质谱(GC-EI-MS)可以对这些农药同时进行定性和定量分析，虽然 EI-MS 所获取分析物质的信息丰富，但容易受到试样基体的干扰而降低方法的灵敏度和抬高方法的最小检出浓度(LOQ)。 负化学离子源-质谱法(NCI-MS)的 NCI 源被尔为‘软电离源'，对含电负性基团的分析物具有高选择性和高灵敏度；国外学者已经将GC-NCI-MS 应用于多氯联苯、卤代烃、有机氯和有机磷农药等分析研究[6~8]，证明了其在分析电负性物质方面是比GC-FPD、GC-NPD和GC-EI-MS更具优势的分析方法。有机磷农药均含有电负性基团，所以此法可成为该类痕量农药残留的特征分析方法。 在蔬菜水果的试样前处理过程中，试样中可溶性物质会随农药残留一起被提取，当采用纯溶剂混合标准曲线法(Solvent Calibration，简称：SC法)时， 由于 SC法所采用的纯溶剂与试样提取液的基体差异，会导致基体效应(Matrix Effect)的产生。Eenry 等人在研究改进基体效应对有机磷农 药残留的GC-NPD分析结果的影响时，深入探讨了基体效应问题并提出降低基体诱导色谱响应增强(Matrix-induced Chromatographic Response Enhancement，简称：MCRE)影响的措施。在减小或降低基体效应影响的措施中，由于空白试样基体匹配校准曲线法(Matrix-matched Calibration，简称：MC法)效果显著而被广泛采用[10]，有机磷农药残留分析的基体效应问题还有一些相关的报道[11~13]。目前，国内关于GC-NCI-MS SIM 和MC法同时分析蔬菜水果中多种有机磷农药残留的报道较少。 本文将GC-NCI-MS选择离子监测方式(SIM)应用于蔬菜水果九九种有机磷农药残留的同时分析，初步解析了这些农药NCI-MS的特征阴离子结构和断裂机理，并探讨了有机磷农药残留分析中的基体效应问题，采用MC法定量分析，有效地降低了基体效应的影响。 实验部分 1.1 仪器与试剂 仪器： Shimadzu GC/MS-QP 2010气-质联用仪(日本岛津公司)，配备EI、PCI、NCI源； Lab So-lution 2.10色-质工作站； PHILIPS HR 7633 食品加工机(广东珠海飞利浦公司)； KQ 3200E超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)； DK-S22 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；自制的氮吹浓缩装置。 试剂：丙酮和乙酸乙酯，均为农残级试剂(Absolve，美国 Tedia公司)；分析纯无水硫酸钠(中国医药集团上海化学试剂分公司)。 农药标准物质：甲拌磷、乐果、二嗪农、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、毒死碑、稻丰散、三硫磷和乙硫磷，浓度均为100±0.15og·mL，丙酮介质(中国农业部环境保护科研监测所)。 农药标准溶液配制：采用丙酮将各农药标准物质溶液稀释成10.0cg·mL的标准储备液；再根据分析需要，用丙酮配制成系列浓度的混合标准溶液。 1，2 试样的前处理过程 提取与浓缩：去除蔬菜水果试样的非食用部分，置于食品加工机内搅碎，搅拌均匀；称取10.0g搅碎试样于100mL玻璃离心管中，加入30mL乙酸乙酯提取剂，置于超声波清洗器内超声提取15min， 离心5min，转移出上层提取液；残渣再分再用20、10mL提取剂超声提取10min， 离心5min， 合并三次提取液，加入适量无水硫酸钠除水后置于45℃恒温水浴中，氮吹浓缩至近干，用丙酮定容至1.00mL，供以下仪器分析。 SC 法系列混合标准溶液的配制： 将10.0 cg·mL-的标准储备液用丙酮稀释成分别含有50、100、200、400、600、800、1000ng· mL九种有机磷农药的 SC 法系列混合标准溶液(都含 100ng· mL-的乙硫磷内标物)。 MC法系列标准溶液的配制：选取空白蔬菜水果试样(经分析九种有机磷农药均小于LOQ，本文以西红柿为实验体系)，经提取与浓缩步骤处理后，添加九种有机磷农药混合标准溶液和乙硫磷内标物标准溶液，作用数小时后，用丙酮定容至1.00mL；配制与SC法相同浓度的MC法系列混合标准溶液。 加标回收试样的制备：准确确取10.0g空白蔬菜水果试样(经分析九种有机磷农药均小于LOQ，本 文以西红柿为实验体系)，分别加入不同浓度水平的九种有机磷农药混合标准溶液和内标物标准溶液，作用数小时后，分别按实验步骤进行提取和浓缩。 1.3 GC-NCI-MS分析条件 GC分析条件： DB-5MS毛细管色谱柱(30mx0.25mm×0.25ocm)；高纯He载气(纯度>99.999%)；柱头压61.8 kPa；恒线速度37.5 cm·sl；进样体积1.00oL(不分流进样)；进样口温度250℃；接口温度250℃；柱升温程序设定：120℃→25℃·min1→230℃→2℃·min→236℃一20℃·min1→270℃(保留2min)；内标法定量(以峰面积计算)。 NCI-MS分析条件：甲烷反应气(纯度99.95%)；反应气输出压力2.5 kg·cm?； NCI 源真空度 3.00×10Pa，温度200℃；离子化电压70eV，灯丝电流60A，检测器电压1.02kV； 全扫描(Full Scan)方式定性分析，扫描间隔0.4s； SIM方式定量分析，扫描间隔 0.2s。 2 结果与讨论 2.1 NCI-MS特征阴离子结与与断裂机理的初步解析 为了准确识别有机磷农药NCI-MS的特征阴离子与试样基体、进样口隔垫和色谱柱固定液流失等产 图1 甲拌磷的 NCI-MS 图图与解析 图3 二嗪农的 NCI-MS 谱图与解析 图5 杀硫的 NCI-MS 浩图与解析 图2 乐果的 NCI-MS 谱图与解析 图4 甲基对硫磷的NCI-MS谱图与解析 图6 马拉硫磷的NCI-MS 浩图与解析 图7毒死的 NCI-MS 谱图 w= 图9乙乙磷的 NCI-MS 谱图与解析 图8稻丰散的 NCI-MS 谱图与解析 图10三硫磷的 NCI-MS 谱图与解析 图11毒死蜱的NCI-MS 解析 生的干扰离子，特别对这些农药和内标物NCI-MS的特征阴离子结构和断裂机理进行初步解析。 图1~图10为九种有机磷农药和内标物(图9)的 NCI-MS 谱图以及特征阴离子的结构与断裂机理的初步解析结果。 从图1、图2、图3、图8和图9可以看出，这几种农药的离子(1)都是分子离子，由于它们在NCI源中不稳定，所以在NCI-MS 谱图中基本观察不到；离子(2)都是由离子(1)经半异裂脱去自由基后的阴离子碎片，是 NCI-MS分析中主要的特征阴离子。从图10还可以看出，除了离子(1)和离子(2)与以上所述相同外，离子(3)与离子(2)的作用机理也相同，仅是脱去不同的自由基。 从图4、图5和图6可以看出，离子(1)和离子(2)与以上所述相同，但是还存的离子(3)是离子(1)经过一系列重排、脱去中性分子后的阴离子碎片。 图7是毒死蜱的NCI-MS谱图，与其它有机磷农药不同的是其NCI-MS的特征阴离子较多，其特征阴离子的结构和断裂机理初步解析结果见图11。从图11可以看出，离子(1)是分子离子，离子 (2)和离子(4)都是离子(1)脱去 HCl和 Cl2后的奇电子阴离子，离子(3)和(7)都是离子(1)脱去自由基后的阴离子碎片，离子(5)、(6)、(8)和(9)都是离子(1)经过一系列重排、断裂和脱去中性分子后形成的阴离子碎片。 从图1~图11可以清楚看出，这些农药的NCI-MS均由少数特征阴离子组成，而且相对丰度都较高，与 EI-MS 的阳离子碎片相比特征离子少且集中。 表1内标物(IS)和九种有机磷农药的保留时间、SIM分组时间设定、特征离子和SC 法的一元线性回归与二项式回归数据比较。 农药 保留 分组时间 一元线性回归分析 二项式回归分析 时间 设定 特征离子 相对丰度 回归方程： y=a+b*x R a b 回归方程：：y=a+b*x+c*x² R’ a b c /min /min m/z /% 1甲拌磷 10.49 10.00~10.62 185 100 -2.1429 1.6607 0.9856 -0.3517 0.4702 0.1488 0.9970 2乐果 10.71 10.62~10.90 157 100 -0.3792 0.3307 0.9797 -0.0105 0.0636 0.0264 0.9995 3二嗪农 11.02 10.90~11.42 169 100 -0.4130 0.4732 0.9907 -0.0591 0.0253 0.2168 0.9998 4甲基对硫 11.76 11.42~11.96 154，263 100，15 -0.0753 0.4292 0.9979 -0.1086 0.4533 0.0024 0.9981 5杀螟硫磷 12.09 11.96~12.24 168，277，141 100，25 -0.2910 0.6212 0.9974 -0.28340 0.6157 0.0005 0.9974 6马拉硫磷 12.17 11.96~11.24 157，172 100 -0.5701 0.8065 0.9929 -0.0414 0.4235 0.0378 0.9999 7毒死蜱 12.32 11.24~12.72 313，315， 100，87， -3.5020 5.6860 0.9916 +0.32122.9165 0.2733 0.9989 212，214，169 73，72，70 8稻丰散 13.14 12.27~14.00 157 100 -1.1886 1.5891 0.9911 -0.0133 0.7377 0.0840 0.9999 IS乙硫磷 14.80 14.00~15.07 185 100 9三硫磷 15.26 15.07~16.50 185，143 100，54 -2.6937 4.4478 0.9948 -0.1845 2.6302 0.1794 0.9999 2，2(GC-NCI-MS分析 NCI-MS特征阴离子的选择：在选定的实验条件下，首先通过 GC-NCI-MS 的全扫描方式(m/z=33~550)得到总离子流色谱图(TIC)，然后根据NCI-MS 和 TIC 谱图选择相对丰度较高和m/z较大的特征阴离子进行GC-NCI-MS SIM分析，九种有机磷农药和内标物的保留时间、SIM方式的分组时间设定和特征阴离子的选择见表1。分析结果表明，这些 SIM 特征阴离子反映出分析物的主要特征，分析的灵敏度高、选择性好、基体效应的影响小和定量分析准确。 GC-NCI-MS分析：图12是根据表1所选择的特征阴离子，在选定的实验条件下分析：(a)空白西红柿试样、(b)西红柿试样、(c)加标空白西红柿试样(加入九种有机磷农药标准的浓度水平为100 og·kg和内标物100 og·kg)、(d)空白苹果试样、(e)苹果试样和(f)加标空白苹果试样(加标浓度同(c))的 GC-NCI-MS SIM 色谱图。从图12的(a)和(c)空白试样色谱图可以看出，在NCI的 SIM 方式下，空白试样的背景干扰非常小，背景噪声基本与仪器噪声处于同一水平。从图12的(c)和(f)加标空白试样的色谱图也可以看出，除了空白试样的背景干扰非常小外，九种有机磷农药和内标物都达到完全的色谱分离，同时具有较高的灵敏度。从图12的(d)和(e)试样的色谱图还可以看出，试样中存在部分少量的农药残留，基体的干扰也非常小。图12中同样浓度下不同农药的响应信号相差较大，这是因为不同的有机磷农药在NCI-MS中断裂差异造成。 2.3 MCRE 的影响与 SC 法分析数据的比较 有机磷农药残留分析中MCRE的影响：由于溶解于纯溶剂中的农药标药物质在进行GC-NCI- 图12 GC-NCI-MS SIM 色谱图： (a)空白西红柿试样、(b)西红柿试样、(c)加标空白西红柿样样(加入九种有机磷农药标准的浓度水平为100mg.kg' 和内标物100mg·kg)、(d)空白苹果试样、(e)苹果试样、(f)加标苹果试样(同(c))，图中数字标记色谱峰所代表的农药见表1。 图13 SC法中六种有机磷农药 GC-NCI-MS SIM分析的峰面积与浓度关系图。 图 14 MC法中六种有机磷农药 GC-NCI-MS SIM分析的峰面积与浓度关系图。 表2九种有机磷农药 MC 法(以西红柿试样为例)的一元线性回归方程、R、检测限和平均回收率与 RSD(n=5) MC法线性回归方程 空白西红柿试样加标浓度水平 /og.kg 农药 y=a+b*x 检测限 100 400 800 b a R /g.kg平均回收率/% RSD/%平均回收率/% RSD/% 平均回收率/% RSD/% 1甲拌磷 phorate 0.0615 0.0175( 0.9997 1.0 78 10.4 82 1.20 85 1.16 2乐果 dimethoate 0.0389 0.0333 0.9998 0.25 96 0.87 97 4.41 91 2.44 3二嗪农 diazinon 0.0944 0.0007 0.9995 0.85 100 1.28 94 2.09 93 2.95 4甲基对硫磷 mehyl-parathion 0.5163 -0.1283 0.9993 0.22 116 7.34 94 2.58 90 1.38 5 杀螟硫磷 fenitrothion 0.6486 -0.0819 0.9995 0.34 109 4.62 95 1.89 91 2.37 6马拉硫磷 malathion 0.2717 0.0454 0.9997 0.53 105 4.75 99 2.63 94 3.21 7毒死蜱 chlorpyrifos 0.8667 0.407 0.9993 0.12 126 14.7 118 13.2 113 8.94 8稻丰散 phenthoate 0.5082 0.00170.9998 0.43 99 0.58 94 1.21 92 2.50 IS 乙硫磷 ethion 9三硫磷 carbophenothion 1.4264 0.1463 0.9996 0.21 96 0.83 100 2.32 95 4.35 MS分析时，分析物被气化室衬管内表面上的活性位点吸附与降解，致使分析物不能及时、全部转移入色谱柱内分离后检测，因此分析信号强度偏低；而分析试样时，由于试样提取液中的基体组分能够覆盖和掩蔽衬管内的部分活性位点，降低了分析物被吸附与降解的程度，从而使分析物基本能够完全进入色谱柱内分离后被检测，因此增强了分析信号的强度。这样以SC法分析试样得到的结果就会偏高。影响 MCRE 大小的主要因素有[14]：基体类型、分析物分子结构与极性、分析物与基体组分的浓度比、仪器使用状况、进样口的类型及形状等。目前主要采用以下几种措施减少或补偿MCRE带来的影响：提高前处理的净化效率、优化进样技术、采用MC 法和校正函数法等。 SC法的一元线性与二项式回项分析结果：分别取1.00 ocL 浓度分别为50、100、200、400、600、800、1000 og ·kg 的SC 法有机磷农药系列标示混合溶液进行 GC-NCI-MS SIM 分析，获取各自的GC-NCI-MS SIM色谱图。选取五种有机磷农药的六个浓度，以分析物的物面积(PeakArea)对分析物的浓度(C/cg·kg)作图(图13)。从图13可以看出，分析物的峰面积随分析物的浓度增大趁呈增大的趋势，但是呈非线性关系。以分析物与内标物的峰面积比值(y)对分析物与内标物的浓度比值(x)作-元线性回归分析和二项式回归分析，数据见表1。从表1可以看出，对于九种有机磷农药，大部分呈现二项式回归分析结果比-一元线性回归分析结果更符合实验数据的分布。若采用 SC法的一线线性回归方程定量分析这些农药残留，分析结果的准确度将会受到极大的影响。 2.4 MC 法一元线性回归分析结果 MC法的线性回归方程、相关系数(R)和MDL：分别取1.00 oL 与SC法浓度相同的MC法有机磷农药系列标准混合溶液进行 GC-NCI-MS SIM 分析，获取各自的GC-NCI-MS SIM 色谱图。选取同样五种有机磷农药的六个浓度，以分析物的峰面积对分析物的浓度作图(图14)，从图14可以看出，低浓度与高浓度水平的峰面积与浓度均呈良好的线性关系。而且的MC法的峰面积比SC法的峰面积增大了2~3倍。以分析物与内标物的峰面积比值(y)对分析物与内标物的浓度比值(x)作一元线性回归分析，得到的线性回归方程、相关系数(R)和LOQ见表2。从表2中可以看出，九种农药在所分析的浓度范围内均呈良好的线性关系， R=0.9993~0.9998， LOQ为0.12~1.0 og.kg。 MC法的加标回收率和相对标准偏差(RSD)：称取10.00g空白西红柿试样分别添加相当于试样含100、400、800cg·kg浓度水平的九种有机磷混合标准溶液，按选定的实验条件平行分析5次，分析结果的平均回收率和RSD列于表2；从表2可以看出，平均回收率为79.9%~126%， RSD 为0.58%~14.7%，符合痕量农药残留分析的要求。 2.5 蔬菜水果试样MC 法分析 将GC-NCI-MS SIM的MC法应用于蔬菜与水果(所有样品均采购于当地大型超市)中多种有机磷农药残留的同时分析。结果表明，除在西红柿中分析出甲基对硫磷为167 g ·kgl和毒死蜱为 1860g·kg，在黄瓜、茄子、苹果和桔子试样中均未检出这些有机磷农药。 3 结论 本文对蔬菜水果中九种有机磷农药残留的 GC-NCI-MS SIM 分析方法进行了探讨，考察了方法的线性关系、线性范围、LOQ、空白试样加标回收率及 RSD/%等指标，并对有机磷农药的基体效应问题进行了初步的探讨，建立了蔬菜水果中多种有机磷农药残留的 GC-NCI-MS分析方法。 ( 参考文献 ) ( [1] GB/T5009.145-2003，植物性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 ) ( [2] J. 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