生脉饮煎剂中人参皂苷类成分检测方案(液质联用仪)

生脉饮煎剂中人参皂苷类成分的HPLC/UV/MS分析 北京大学药学院：王占良 摘要目的：采用HPLC/UV/MS法对生脉饮煎液的人参皂苷类成分进行了分析。方法：采用YMC-Pack ODS-AC-18柱；以乙腈和10mM/L醋酸铵为流动相进行梯度洗脱，流速1.0mL/min。结果：得到了初步分离的总皂苷类成分的色谱图，图过 HPLC /MS 的结果对色谱峰进行了初步指认。结论：本方法可用于生脉饮总皂苷成分的测定，可用于控制生脉饮的质量。 关键词：生脉饮人参皂人成分 HPLC/UV /MS 生脉饮是著名的中医古方之一，始载于《医学启源》由人参、麦冬、五味子3味中药组成，具有“益气复脉、养阴生津”的功能。近年诸多临床研究表明，生脉饮广泛用于治疗心血管疾病，如：冠心病、心肌缺血、心律失常、心力衰竭、高血压、低血压以及各种休克等，已成为中医急症的常用方剂。在六五、七五、九五"期间，生脉饮作为国家重点科研项目，从药材品种、化学成分、组方原理、作用机理等方面对生脉饮进行了系统的研究。成果显示生脉饮煎剂的药效明显优于复方中的各单味药或者两两配伍，而且生脉饮煎剂中人参皂苷发生了转化，有些皂苷的含量增加，有些皂苷的含量减少。因此对生脉饮中的皂苷成分进行分析将有助于我们了解其特殊疗效的物质基础，阐明组方药材的相互作用，发现新的活性成分。本文报道了生脉饮总皂苷类成分的 HPLC/UV色谱图，并且通过 HPLC /MS 图谱对主要色谱峰进行了初步指认，为控制生脉饮煎剂的质量提供了参考。 1仪器与试剂 1.1仪器 Shimadzu LCMS-2010EV 高效液相色谱-质谱联用仪(含LC-20AB二元泵，在线真空脱气机，恒温自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口的四极杆质谱检测器以及 LC/MS solution 3.1 色谱工作站)，Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore Inc.USA)， Nz发生器 (ANEST IWATA) 1.2试剂 乙腈(fisher， 色谱纯)，甲醇(fisher，色谱纯)，双蒸水，其余试剂为分析醇。生脉饮中各单味药均选用地道药材，红参为五加科植物人参 Panax gingeng C.A.Mey的干燥根茎蒸制的加工品；麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker-Gawl的干燥块根；五味子为木兰科植物五味子Shisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。以上药材均由北京院学药学院天然药物学系陈世忠教授鉴定。 2方法和结果 2.1供试品溶液的制备 参照2005版《中国药典》一部生脉饮组方成分的比例，取红参50g， 麦麦100g，五味子50g，分别加水8，6，6倍量，按照2，1.5，11小时进行煎煮，放冷后用正丁醇萃取煎剂，依次以1.5%NaHCOs洗涤三次，水洗三次，浓缩至干加水分散，进行大孔树脂 HPD-400A进行色谱分离，依次用30%、70%、90%乙醇进行洗脱，70%部分洗脱液在50摄氏度以下进行浓缩，浓缩液进行冻干，得到干燥的固体，即为生脉饮总皂苷。取此固体2mg，用甲醇定容到2mL的容量瓶中，滤过 0.45cm的滤膜，即得供试品溶液。 2.2色谱条件与测定方法 色谱柱： YMC-Pack ODS-A C18柱(150mm × 4.6mm，5cm)；流动相：10mM醋酸铵(A)乙腈(B)，梯度洗脱条件：0~30min (60%-40%A)， 30~40min(40-30%A)；流速1mL/min；检测波长203nm；柱温40℃；柱后分流0.3mL/min 进入质谱仪；记录总离子流图(TIC)。 质谱参数：质谱检测模式：电喷雾离子化(ESI)；离子极性： Negative； 雾化气流速1.5L/min， 反吹气0.04MPa，曲形脱溶剂装置(CDL)温度：250℃；加热块(Block)温度：200℃；探针(Probe)电压4.5kV；检测器电压1.50kV。N2纯度(99.99%)。 2.3结果 生脉永总皂苷成分的 HPLC/UV 图谱见图1， HPLC/MS 图谱见图2。 Figure. 1 The chromatograms of total saponin in sheng-mai-yin decotion Figure. 2 The TIC of total saponin in sheng-mai-yin decotion 3讨论 通过质谱和色谱图得到的信息并参考有关文献I2-51，我们对总皂苷中的成分进行了初步指认，结果见表1，各成分的质谱图见图3。 Figure.3 MS spectra of peaks in Table.1 Intenx100.0001 IntenX100.0001 242.05 人参皂苷Rf 20- 85905 91365 1.0- 798.50862.60 0. 38500 521.10 250100505 200548635 57540633356R530 LB5600215510925511984 200 300 400 550 TM 600 760 800 000 1000 1100 m2 Retention time 4.086 20Imenx1000.000) 89760 1.5- 人参皂苷Rg2 10- 0.5 249.00 Retention time 5.673 75 Retention time 13.594 人参皂苷Rg6 825.55 249.00 2 520.82 765.55 9255 10465 1129.55 Retention time 18.921 Retention time 19.778 Intenx1.000.000) Retention time 22.057 Retention time 28.901 Retention time 30.023 Table.1 HPLC/UV/MS identification Retention time Identification [M-H M+Ac01 [M+AcO+NH4+CL M+CIT 4.086 Rf 799.50 859.65 913.65 5.096 Rg2 783.55 843.60 897.60 5.425 Rg iso. 783.50 843.55 897.55 5.673 Rhi 637.40 697.55 751.45 6.248 Rhiiso. 637.40 697.55 751.45 13.594 Rg6 765.60 825.50 879.50 14.675 Rg iso. 765.60 825.50 879.50 15.479 Rks 679.50 733.50 655.55 16.678 Rh 679.50 733.45 655.50 18.921 Rgs 783.60 843.60 897.55 19.778 Rg iso. 783.60 843.60 897.55 22.057 Protopanaxatriol 475.55 535.55 22.700 Protopanaxatriol iso. 475.55 535.55 28.901 Rgs 765.55 825.55 879.50 30.023 Rki 765.55 825.55 879.55 31.698 Rh2 681.50 735.40 657.50 32.460 Rh2iso. 681.55 生脉饮中的皂苷类成分与其各个单味药(尤其是人参)相比，无论是在种类还是含量上，都发生了很大变化。从种类上看，人参中原先含有的人参皂苷Rg、Re、Rd、Ra等都消失了，取而代之的是人参皂苷Rgs、Rki、Rgo、Rh4、Rks以及 Protopanaxatriol；与之相比，新产生的成分有着更好的口服吸收，更高的血药浓度，而它们的药理活性有待于进一步研究。从含量上看，生脉饮中含量较多的是人参皂苷Rgs、 RhzRg、Rki、Rgg等，含量的变化必然引起作用的变化，生脉饮具有的特殊药理作用就不言而喻了。 LC/MS 联用具有更低的检测限，对于紫外吸收很弱的皂苷类成分更为适合。不仅弥补了 UV 检测器的不足，而且通过质谱图可以得到很多化合物结构方面的信息，对峰的指认有很大帮助，还可以用于未知化合物峰结构的推测。 致谢感谢岛津公司分析测试中心在 HPLC/MS方面提供的帮助。 ( [参考文献] ) ( [1].严永清.生脉散口服液的综合研究.北京：中国医药科技出版社，1990. ) ( [2]. Haijiang ， Zhang； Yongjiang， Wu； Y iyu， C heng .Analysis o f 'SHENMAI' injection by HP L C/MS/MS . Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis . 2003，31(1)175-183. ) ( [3]. Xiu-Sheng Miao， Chris D. Metcalfe， Chunyan Hao.Electrospray ionization mass spectrometry of ginsenosides.Journal of Mass Spectrometry. 2002； 37：495-506 ) ( [4]. Geoffrey c.kite， Melanie-jayne R. Howes， Monique S.J.Simoonds. Liquid chromatography/mass spectrometry ofmalonyl-ginsenosides i n the authentication of ginseng. Rapid Communications in Mass Spectrometry . 2003， 17：238-244. ) ( [5]. N . Fuzzat i ， B. Gabetta， K . Jayakar. Liquid c hromatography-electrospray mass spectrometric identification ofginsenosides in Panax ginseng r oots. Journal of Chromatography A， 1999，854： 6 9-79. )