15 种注射用头孢菌素中无菌检查检测方案(集菌仪)

·药品监督 · ·药品检验· 15种注射用头孢菌素无菌检查方法研究 李 玮，许威，马仕洪(1.安徽省药品检验所，合肥市 230051；2.中国药品生物制品检定所，北京市 100050) 中图分类号 R927 文献标识码 C 文章编号 1001-0408(2007)25-1971-03 摘 要 目的：逐步建立统一的注射剂无菌检查方法标准。方法：按2005年版《中国药典》规定，采用薄膜过滤法对15种注射用头孢菌素进行系统的无菌检查方法研究。结果：各头孢菌素有不同程度的抗菌活性，但在冲洗液冲洗500mL ·筒加酶量300万IU·筒的试验条件下，抑菌活性均可消除。结论：无菌检查方法的验证是必要的，头孢菌素无菌检查方法可以统一，形成标准操作规范。 关键词 注射用头孢菌素；无菌检查；方法学验证 Validation of Sterility Test Methods of 15 Cephalosporins for Injections LI Wei ，XU Wei (Anhui Institute for Drug Control，Hefei 230051 ，China) MA Shihong (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biolo gical Products ，Beijing 100050) ABSTRACT OBJECTIVE： To establish step by step the unified criteria for the sterility test methods of cephalosporins.METHODS：According to the China Pharmacopoeia (2005 edition) ，sterility test methods of 15 cephalosporins were studied bymembrane - filter procedure.RESUL TS： Various cephalosporins showed different degree of antibacterial activity， but whichcould be counteracted by the added rinse solution (at a dosage of 500mL/ cartridge) and enzyme (at a dosage of 3 000 000 IU/cartridge). CONCLUSION：The verification for sterility test methods of cephalosporins is necessary ，and the sterility test meth-ods of cephalosporins can be unified to be standardized operation criteria. KEY WORDS Cephalosporins for injection；Sterility tests；Method validation Tab 2 Clarity of preparation at different time before andafter improvement 组别 时间/h 0 24 48 72 240 原处方 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 改进方 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 生改变。为对比检验新制剂对皮肤的刺激性，分别配制浓度为0.3%、2%的硫代硫酸钠水溶液，并分别涂于20例受试者的手臂和大腿内侧皮肤上，左侧涂0.3%硫代硫酸钠水溶液，右侧涂2%硫代硫酸钠水溶液，24h内观察两侧试验部位的皮肤：左侧均未出现发红、起疹、水疱、干裂等皮肤刺激现象，右侧也均未出现上述皮肤刺激现象。表明增加硫代硫酸钠含量不会对皮肤产生刺激性。需要说明，由于硫代硫酸钠涂剂中含有乙醇，乙醇对皮肤产生刺激性，这是公认的事实。改进的处方中减少了乙醇的含量，无疑将减小对皮肤的刺激性。 3.7 脱碘作用 改进前、后处方所配制的硫代硫酸钠涂剂经我院麻醉手术室使用，用于手术患者3%碘酊消毒手术部位的脱碘：共观察1000例手术病例(改进前、后各500例)，其中使用改进前处方的500例中有347例(约2/3)脱碘不完全，表现为脱碘后皮肤表面仍残留有少量碘的淡黄色，用涂剂反复擦拭，淡黄色始终不能褪去(平均每例使用涂剂500mL)。使用改进后处方的500例中，全部达到完全脱碘，表现为脱碘后皮肤表面看不见黄色物(平均每例使用涂剂200mL)。可见，处方改进后涂剂的脱碘作用明显强于改进前。 4 讨论 ( *主管药师，硕士。研究方向：抗生素药品检验。电话：0551- 3358053-2069。E - mail ：liwow @126.com ) 改进的处方中增加了硫代硫酸钠含量(原处方为0.3%，改进后处方为2.0%)，使脱碘反应中与碘反应的硫代硫酸钠浓度增大，因而碘与硫代硫酸钠的氧化还原反应更充分完全。硫代硫酸钠涂剂脱碘主要利用硫代硫酸钠的还原作用，使碘还原成碘离子，其化学反应式为：I2+2Na2S2O：→Na2S4O6+2NaI。通过理论计算，1g碘需约1.24g硫代硫酸钠与其完全反应。适当增加处方中硫代硫酸钠的含量，促使上述氧化还原反应向正反应方向发生，能够使脱碘作用更为迅速、彻底。 处方中也增加了水的含量，反应过程中生成的碘化钠会溶于水，通过擦拭皮肤，在带走水分的同时，碘化钠也会随之被带走，也有利于上述氧化还原反应向正反应方向发生，促进脱碘反应的进行。同时，处方中乙醇和水的用量比例改变，减少乙醇用量，不仅使硫代硫酸钠涂剂的成本降低(详见表1)，也减小了对皮肤的刺激性。 综上所述，依据改进的处方所配制的硫代硫酸钠涂剂质量更加稳定，成本较《中国医院制剂规范》中标准处方的制备成本更低，脱碘作用更加迅速、完全，对皮肤的刺激性更小，值得推广。 ( 参考文献 ) ( [1] 中华人民共和国卫生部药政局编.中国医院制剂规范(西 药制剂)[S].第2版. 北京：中国医药科技出版社，1995： 107、1 1 2. ) ( [2] 国家药典委员会编.中国药典(二部)[S].2005版.北京： 化学工业出版社，2005：715、附录18 、 61、93. ) ( [3] 曹 健，张恩娟，黄林清，等.新疣克星酊剂的制备及质量 控制[J].中国药房，2004，15(11)：672. ) ( (收稿日期：2006-09-17 修回日期：2007-01-23) ) 无菌是注射剂质量控制的一个重要指标。根据2005年版《中国药典》要求，注射剂无菌检查前需进行方法验证，即试验过程中每一环节(尤其是样品的抑菌性)均应有合理的证明，避免对检验结果的误判。目前虽然有一些无菌验证方法陆续报道2.31，但因每种药品抑菌活性不同，各地试验水平也不同，结果的重现性也难得以保障。且不当的无菌试验方法(如采用1000mL/筒以上的过大冲洗量)易使阳性菌检出率降低。有报道详细讨论了缺乏验证方法所造成的问题。因此，制订注射剂无菌检查方法的指导原则显得尤为重要。中国药品生物制品检定所提出制订“注射用头孢菌素无菌检查方法标准操作规范草案”，目的是以头孢菌素类抗生素为范例，逐步对注射剂无菌检查方法进行统一。笔者参与了了项工作，对收集的不同厂家17个批次的15种注射用头孢菌素进行了系统无菌检查方法学研究。 材料 1.1 样品 注射用盐酸头孢吡肟(北京太洋药业有限公司，规格：1.0g，批号：060101)；注射用头孢噻肟钠(规格：1.0g，批号：050906)、注射用头孢拉定(规格：1.0g，批号：050830)、注射用硫酸头孢匹罗(规格：1.0g，批号：051102)、注射用头孢哌酮钠(规格：2.0g，批号：050927)、注射用头孢曲松钠(规格：2.0g，批号：050825)、注射用头孢他啶(规格：1.5g，批号：050713)注射用头孢西丁钠①(规格：1.0g，批号：050819)、注射用头孢匹胺钠(规格：1.0g，批号：051106)、注射用头孢噻吩钠(规格：1.0g，批号：050918)、注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠①(规格：1.0g，批号：060804)均由安徽先锋制药有限公司生产；注射用头孢呋辛钠(规格：1.5g，批号：041025)、注射用头孢米诺钠(规格：0.5g，批号：040401)均由安徽威尔曼制药有限公司生产；注射用头孢尼西钠(上海今科全椒制药有限公司，规格：1.0g，批号：050508)；注射用头孢替唑钠(规格：1.5g，批号：051205)、注射用头孢西丁钠②(规格：1.0g，批号：060201)均由海南卫康制药潜山有限公司生产；注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠②(国药集团国瑞药业有限公司，规格：1.0g，批号：0605030)。 1.2 菌液 大肠埃希菌(Escherichia coli) (CMCC(B) 44102)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(CMCC(B) 26003)均由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心提供。取经37℃培养24h的上述2种菌种的营养肉汤培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成10~100cfu·mL，经活菌计数后备用。 1.3 仪器 HTY-2000A 型集菌仪(浙江杭州高得医疗器械有限公司)；一次性全封闭集菌培养器(浙江杭州泰林生物技术设备有限公司)， 1.4 培养基、中和剂及冲洗液 硫乙醇酸盐液体培养基(北京三药科技开发公司，批号：0601182)；β-内酰胺酶(北京科技协作中心中国药品生物制品检定所分部，规格：300万IU·mL，批号：20060103)，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成120万IU·mL， 与原液(300万IU·mL)均作为中和剂用；0.9%无菌氯化钠溶液、0.1%无菌蛋白胨水溶液系安徽省药品检验所自制。 2 方法与结果 2.1 薄膜过滤法 取样品10支，分别用0.9%无菌氯化钠溶液5mL溶解，全 部转移至500mL 无菌氯化钠溶液中，作为样品溶液备用；取一次性全封闭集菌培养器，先用冲洗液(0.1%无菌蛋白胨水溶液)润湿滤膜，再每筒过滤上述样品溶液 50mL ，滤干后用冲洗液冲洗，每次100mL，分别冲洗400、500mL，在最后一次的冲洗液中分别加入大肠埃希菌、金金色葡萄球菌菌液1mL，滤干后分别灌注100mL 已灭菌的硫乙醇酸盐培养基，并加入β-内酰胺酶(300万IU·mL或120万IU·mL ) 1mL 作为中和剂消除样品的抑菌作用.另取集菌培养器，不加样品重复操作，作为阳性对照；再取集取培养器过滤冲洗液500mL ， 分别加入同浓度β-内酰胺酶液1mL，作为阴性对照。以上容器均置于培养箱(32.5±2.5)℃培养 48h，目测观察结果。样品管中培养基与阳性管同样混浊则有菌生长，说明残余头孢菌素的抑菌作用得到去除，试验结果未受样品干扰。 2.2 试验结果 各头孢菌素的抑菌活性不同，在相同的冲洗量与加酶量条件下，试验结果亦不相同。其中，“500mL+”表示冲洗500mL的冲洗液经培养目测观察有菌生长，“500mL-”表示冲洗500mL 的冲洗液经培养目测观察无菌生长。结果详见表1(其中加酶量为万IU/筒)。 表1 在不同试验条件下各头孢菌素阳性菌生长情况 Tab 1 Growth of various cephalosporin positive bacteriaunder different test conditions 样品 加酶量 冲洗量 大肠埃希菌金黄色葡萄球菌 注射用盐酸头孢吡肟 120 500mL · 500mL + 300 500mL + 注射用头孢噻肟钠 120 500mL - 500mL + 300 500mL + 注射用头孢拉定 120 500mL + 500mL + 注射用硫酸头孢匹罗 300 500mL+ 500mL + 注射用头孢呋辛钠 120 500mL - 500mL + 300 500mL + 注射用头孢哌酮钠 120 400mL+ 400mL- 300 400mL + 注射用头孢尼西钠 400mL + 400mL + 注射用头孢曲松钠 500mL + 500mL- 500mL + 注射用头孢替唑钠 500mL- 500mL + 注射用头孢他啶 500mL - 500mL - 300 500mL + 500mL + 注射用头孢西丁钠① 500mL + 500mL+ 注射用头孢西丁钠② 500mL + 500mL + 注射用头孢匹胺钠 500mL + 500mL + 注射用头孢噻吩钠 500mL+ 500mL+ 注射用头孢米诺钠 400mL + 400mL + 注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠① 500mL + 500mL + 注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠② 500mL + 500mL + 3 讨论 大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌对头孢菌素类抗生素最为敏感11，第2代头孢菌素对应的敏感菌一般为金黄色葡萄球菌，第3代头孢菌素对应的敏感菌一般为大肠埃希菌。但本次试验中第2代的头孢呋辛钠对应的敏感菌为大肠埃希菌，第3代的头孢哌酮钠和头孢曲松钠对应的敏感菌为金黄色葡萄球菌。这可能是因本试验先固定冲洗量而调整加酶量，与先固定加酶量而调整冲洗量所得出的敏感菌有所不同所致。另外，第4代的头孢吡肟对应的敏感菌为大肠埃希菌。虽然头孢菌素的抗菌谱在逐渐扩大，但对霉菌、厌氧菌几乎无作用。据以往研究表明，黑曲霉菌、白色念珠菌等加入头孢菌素样品管后，在不冲洗不加酶条件下仍可正常生长。故试验组选择大肠埃希菌与金黄色 表没食子儿茶素没食子酸酯固体粉末的稳定性考察“ 郭 震12*，林坚涛，黄 韧1#，廖艳，王 敏，沈佳娜，吴玉娥(1.广东省实验动物监测所，广州市510260；2.广东医学院药理教研室，湛江市 524023；3. 广东海洋大学分析测试中心，湛江市 524025) 中图分类号 R927.11；R944.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)25-1973-03 摘 要 目的：考察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)固体粉末的稳定性。方法：采用高效液相色谱法测定含量，按照《中国药典》相关规定对影响 EGCG 稳定性的因素进行研究。结果：EGCG检测浓度的线性范围为7.76~77.6ugmL"'(r=0.999 9)；平均回收率为101.29%(RSD=0.76%)；在强光、高温、高湿条件下，EGCG粉末颜色有不同程度的变化，但含量均无明显变化，也未见新的降解物质产生。结论：EGCG固体粉末的稳定性较好。 关键词 表没食子儿茶素没食子酸酯；固体粉末；高效液相色谱法；稳定性 Stability of Epigallocatechin Gallate Solid Po wder GUO Zhen ，HUAN G Ren ，WAN G Min ，SHEN Jiana， WU Yu’e (Guangdong Laboratory Animal MonitoringInstitute，Guangzhou 510260，China) GUO Zhen ，L IN Jiantao (Dept. of Pharmacology， Guangdong Medical College， Zhanjiang 524023， China)L IAO Yan(Research Center of Analysis and Measurement of Guangdong Ocean University， Zhanjiang524025 ， China) ABSTRACT OBJECTIV E： To investigate the stability of epigallocatechin gallate (EGCG) powder. METHODS： The con-tent of the sample was determined by HPLC， and the factors affecting the stability of EGCG were studied according to therelated guideline stated in China Pharmacopeia.RESUL TS： The linear range of EGCG was 7. 76~77.6ugmL (r=0.9999)，with average recovery at 101.29%(RSD=0.76%). Exposed to strong illumination， high temperature and high humidity， thecolor of EGCG powder suffered variant degree of change ， but its content experienced no marked change ， and no new degradedsubstances was noted. CONCLUSION： EGCG powder had a sound stability. KEY WORDS Epigallocatechin gallate；Solid powder；HPLC；Stability 葡萄球菌作为阳性菌进行验证，即可说明试验方法是否干扰了样品检定，保证了无菌检查的有效性。 根据2005年版《中国药典》要求，用β-内胺类药品进行无菌检查时，可在样品溶液、培养基或冲洗液中加入β-内酰胺酶消除其样品干扰。由于标准操作规范形成后将会在全国范围内执行，考虑到以后降低试验成本，故本试验将酶加入培养基中，而不是样品溶液或冲洗液中，在节省加酶量的同时还能使酶与残留药物反应更加完全。另外，注射用头孢拉定、注射用头孢尼西钠、注射用头孢替唑钠、注射用头孢西丁钠、注射用头孢匹胺钠、注射用头孢噻吩钠、注射用头孢米诺钠、注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠在加酶量低至120万IU/筒的条件下，阳性菌即可生长。样品溶液快速过滤后，用冲洗液少量多次进行荡洗(如每次用50mL冲洗液，分10次共冲洗500mL)可进一步减少加酶量，但试验时间有所延长。 由表1可见，上述15种注射用头孢菌素样品，在冲洗量500mL/筒、加酶量300万IU/筒的条件下，敏感菌大肠埃希菌 ( ▲广东省中医药局科研项目(2060038) ) ( *硕士研究生。研究方向：口服固体制剂和毒理学。电话：020- 84182820 ) ( #通讯作者：研究员。研究方向：毒理学。电话： 0 20-34063369. ) ( E -m a il ：labking @gdstc. gov.cn ) 与金黄色葡萄球菌均能正常生长。表明该方法可完全去除各类头孢菌素的抑菌活性，按本法检验所得结果准确、有效。同时说明各类注射用头孢菌素药品的无菌检验方法可简化、统一，形成标准操作规范。而其他各类药品的微生物检查方法，经长期大量的系统方法学研究，也可逐步规范、统一，成为药品标准正文，至于目前缺少验证方法造成的问题也将逐步得到解决。 ( 参考文献 ) ( [1] 国家药典委员会编.中国药典(二部)[S].2005年版.北京： 化学工业出版社，2005：附录89. ) ( [2] 刘贵娟，李 黎.注射用头孢美唑的无菌检查方法[J]. 中国药业，2004，13(12)：44. ) ( [3] 张晓明，何晓英.青霉素粉针剂无菌检查方法的实验研究 [].中国抗生素杂志，2004，29(4)：255. ) ( [4] 钱文静，张 玫.常见抗菌药品无菌检查中有关冲洗量的探讨[J].江苏药学与临床研究，2005，13(3)：63. ) ( [5] 耿敬军，张 俊.药品微生物检查验证试验现状调查与建 议[J]. 中 国药房，2006，17(21)：1652. ) ( [6] 王 睿，方 翼，柴 栋，等.头孢地尼与其他6种β-内酰胺类的体外抗菌活性研究[].中国抗生素杂志，2002， 27(10)：609. ) ( (收稿日期：2007-02-14 修回日期：2007-04-05) ) 中国药房 第第China Pharmacy Vol. No.CChina Academic Journal Electronic Publishing House. 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