益心舒微丸中微生物限度检查检测方案(集菌仪)

维普资讯 http：//www.cqvip.com一730 一药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2007，27(5) 益心舒微丸微生物限度检查法及有效性验证试验研究 向东，张赟华，钱文璟2 (1.云南省食品药品检验所，昆明650011；2.深圳市第二人民医院，深圳518035) 摘要 目的：建立益心舒微丸微生物限度活菌数测定方法。方法：参考中国药典、国外药典等文献进行试验，以对照菌回收为主要内容，用样本组和对照组之间的回收率对方法有效性进行评价。结果：常规法对照用阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率<70%；稀释法对照用阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率<70%；而薄膜过滤法中阳性对照菌的回收率>80%。结论：薄膜过滤法能有效地去除益心舒微丸的抑菌活性，用该法进行微生物物度检查，可行性强，能达到检测目的。 关键词：益心舒微丸；微生物限度检查法；菌数测定；稀释法；薄膜过滤法；验证 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2007)05-0730-03 Expermential study on microbial limit testsand validations of Yixinshu micropills XIANG Dong ，ZHANG Yun -hua，QIAN Wen -jing (1.Yunnan Institute for Food and Drug Control， Kunming 650011，China；2. The Second Hospitol of Shenzhen，Shenzhen 518035，China ) Abstract Objective：To establish the method of the microbial limit viable count tests for Yixinshu micropills.Method：Counting alive microbal test and validation methods refered to the Chinese Pharmacopoeia，American Phar-macopoeia and others literature. The validation have been tested by microbial recovery and the availability was esti-mated by the ratio of recovery from the test group to the control group. Results： Three testing methods had differentratios of recovery：By commonly method， the ratios of Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Candida albicans andAspergillus nigers were <70%. By dilute method， the ratios of Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were <70%. By filtration membrane， all the rations were >80%. Conclusion： The methods of filtration membrane can ef-fectively remove the bacteriostasis activeness. The methods are simple，feasible and accurate. Key words： Yixinshu micropills；microbial limit tests；counting alive microbial；dilute；filtration membrane； validation 益心舒微丸是以人参、麦、五味子、黄芪、丹参等为主药配制而成的一种中药成方制剂，益气复脉、活血化淤，主要用于胸痛及冠心病心绞痛等的治疗。初步试验时发现本品具有较强的抑菌作用，为保证实验结果的客观、真实性，应采取一定的措施消除其抑菌活性。参考中国药典、国外药典等12.3]文献进行试验，以对照菌回收为主要内容，用样本组和对照组之间的回收率对方法有效性进行评价[4.5]。用稀释法和薄膜过滤法对本品进行微生物限度检查，并对方法进行验证，得到理想结果。实验过程如下。 1实验材料与仪器 菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC ( 第一作者 Tel：(0871)3139789；E-mail：xiangdong412@ 126. com ) (B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]；培养基：胆盐乳糖增菌液[批号：060413]，营养琼脂[批号：060906]，营养肉汤[批号：060603]，真菌培养基[批号：0609424]，玫瑰红钠琼脂培养基[批号：060606]；氯化钠-蛋白胨缓冲液[批号：050825]。以上均由中国药品生物制品检定所提供。无菌0.9%氯化钠溶液自配。药物：益心舒微丸(昆明赛诺制药有限责任公司；批号：060101，060102，060103)。 仪器：HTY-2000 集菌仪(杭州市泰林医疗器械厂生产)；集菌培养器(型号：PY330，杭州市泰林医疗器械厂生产)；微孔滤膜(0.45 um)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器器厂生产)。 27方法与结果 2.1供试液的制备取本品10g，加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，用匀浆仪制成1：10的供试液备用。 2.2阳性对照菌液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于营养肉汤培养基中，37℃下培养18h，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至含菌数约为50~100 cfu· mL-的阳性对照菌液 a、b、c，备用；另取白色念珠菌、黑曲霉菌的真菌琼脂斜面培养物接种于真菌培养基中，25℃下培养24 h，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至含菌数约为50~100 cfu· mL的阳性对照菌液d、e，备用。 2.3平皿法(常规法和稀释法) 常规法每皿取供试液1mL；稀释法取供试液1mL，等量分注多个平皿，试验中选用 0.2，0.1 mL。 2. 3.1 阳性对照菌液组 上述阳性对照菌液 a、b、c、d、e各1mL，分别注平平皿，倾注相应培养基培养后计数。 2. 3.2 空白组 供试液1，0.2，0.1mL分别注人平Ⅲ，倾注相应琼脂培养基培养后计数。 2.3.3试验组供试液1，0.2，0.1 mL分别注入平皿，再分别加入阳性对照菌液 a、b、c、d、e各1 mL，倾注相应培养基培养后计数。 各组试验用阳性菌每种2个平皿，试验重复3次。结果见表1。 Tab 1TThe recovery test results using commonly and dilute methods 对照菌 (control 阳性对照组 空白组 1 mL 0.2 mL 0.1 mL 样品批号 样品组 回收率 样品组 回收率 样品组 回收率 (kinds control group)/cfu (blank group) bacteria) (Lot No.) (sample (recovery) (sample (recovery) (sample (recovery) /cfu group)/cfu /% group)/cfu /% group)/cfu /% 大肠埃希菌 100 101 0 0 78 74 76 88 85 86 95 96 95 (E. coli) 101 99 ② 0 0 81 74 78 86 88 86 98 95 96 100 103 ③ 0 0 72 76 73 84 83 83 94 97 94 金葡球菌 54 58 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4 10 (S. aureus) 53 55 ② 0 0 0 0 0 0 0 0 5 6 10 60 57 ③ 0 0 0 0 0 0 0 0 4 7 9 枯草芽孢菌 71 66 ① 0 0 0 0 0 0 0 0 20 18 28 (B. subtilis) 69 70 ② 0 0 0 0 0 0 0 0 17 19 26 72 70 ③ 0 0 0 0 0 0 0 0 16 21 26 白色念珠菌 65 70 ① 0 0 29 25 40 54 55 81 60 65 93 (C. albicans) 66 64 ② 0 0 26 29 42 53 55 83 62 59 93 68 65 ③ 0 0 27 26 40 52 58 83 64 66 98 黑曲霉菌 74 70 山 0 0 22 19 28 36 42 54 68 70 96 (A. niger) 72 69 ② 0 0 24 26 35 40 41 57 71 70 100 71 70 ③ 0 0 20 23 30 38 39 55 69 73 101 2. 4 薄膜过滤法 2.4.1 阳性对照菌液组 上述阳性对照菌液各1mL，分别用孔径0.45 pm，直径约70 mm 的滤膜过滤，并用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液150mL分次冲洗滤膜，取出滤膜，菌面朝上贴于肉汤琼脂培养基平板上，培养后计数。结果见表2。 2、4.2 空白组供试液1mL经滤膜过滤，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 150 mL分次冲洗滤膜，取出滤膜，冲洗面朝上贴于肉汤琼脂培养基平板上，培养后计数。 2.4.3 样品组供试液1 mL 经滤膜过滤，用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液150 mL分次冲洗滤膜，冲洗时分别加入上述相应的阳性对照菌液1 mL，取出滤膜，菌面朝上贴于肉汤琼脂培养基平板上，培养后计数。 各组试验用阳性菌每种2块滤膜，试验重复3次。结果见表2。 2.5 样品微生物限度检查(稀释法和薄膜过滤法)取3批样品按“2.1”项下制备供试液，继续用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：100，1：1000 的供试液，进行活菌计数。 表22薄膜法5种阳性菌回收率试验结果 Tab 2The recovery test results using filtration membrane method 对照菌 阳性对照组(kinds 样品批号 样品组 空白组 回收率 ( control bacteria) control group)/cfu (Lot No.) (sample group)/cfu (blank group)/cfu ( recovery) /% 大肠埃希菌(E.coli) 104 106 ① 91 95 0 0 88 100 103 94 92 0 0 92 99 105 ③ 94 89 0 0 88 金葡球菌(S. aureus) 84 87 ① 70 72 0 0 83 85 91 ② 75 76 0 0 86 86 88 ③ 77 79 0 0 90 枯草芽孢菌(B. subtilis) 102 100 95 88 0 0 90 99 95 ② 92 93 0 0 91 101 96 ③ 90 92 0 0 92 白色念珠菌(C. albicans) 89 82 ① 78 75 0 0 89 87 89 ② 75 82 0 0 87 92 85 ③ 80 82 0 0 91 黑曲霉菌(A. niger) 56 58 ① 54 50 0 0 91 54 61 ② 53 48 0 0 88 60 57 ③ 52 48 0 0 85 2.5.1 细菌计数 以1：10的供试液1mL 加至50mL的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，用孔径0.45 um 的滤膜过滤，并用温度约40℃的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液150 mL 冲洗滤膜，取出滤膜，冲洗面朝上贴于肉汤琼脂培养基平板上，34℃培养48h，计数。结果见表3。 表3 益心舒微丸活菌数测定结果(cfu·g) Tab 3 The microbiao limit viablecount tests for Yixinshu Weiwan 样品批号 细菌 规定 酵母菌、霉菌 规定 (Lot No.)((bbaaccteria) (specification) ) (yeast，streptomyces) (specification) ① 0 ≤30000 0 ≤100 ② 0 ≤30000 0 ≤100 ③ 0 ≤30000 0 ≤100 注(note)：批比(Lot No.) ①060101，②060102，③060103 2.5.2 霉菌和酵母菌计数 以1： 10 的供试液1 mL等量分别注入5个平皿(每皿 0.2 mL)，1：100，1：1000的供试液各1mL分别注入平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，25℃培养72h，计数。结果见表3。 3 讨论 具有抑菌性药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于样品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。检验时应排除其抑菌作用，使之不干扰染菌限度检验，结果方属有效。从以上试验可以看出本品有强的抑菌作用，用稀释法可消除其对霉菌及酵母菌的抑制作用，而薄膜过滤法更 能有效地去除益心舒微丸的抑菌活性。 薄膜过滤法因步骤较多，须严格遵守无菌技术规则，防止污染，在稀释法和薄膜过滤法均可行的情况下，优先选用稀释法。因此在益心舒微丸微生物限度检查方法中霉菌及酵母菌菌数测定采用稀释法，细菌菌数测定采用薄膜过滤法。 采用薄膜过滤法时，益心舒微丸1：10的供试液直接过滤会在滤膜上留下较多药渣，易堵塞膜孔，可先用一般滤纸进行初滤，取滤液再行微孔滤膜过滤可达目的。应选择孔径符合(0.45±0.02) u.m的滤膜，抽滤时应防止压力过大，以免漏液及滤膜破裂。增大滤膜面积可优化过滤效果。 ( 参考文献 ) ( 1 ChP(中国药典).2005.Vol Ⅱ (二部)：Appendix(附录)93 ) ( 2 USP. 28.2752 ) ( BP.2002. A ppendix B A 315 ) ( 4 XIAO Yu-qing( 肖 雨清)， WANG Xuan -bin(汪选斌) ，JIAN Me i - rong(姜美蓉)， et al. Microorganism limi t tes t for ba c teriostatic drugs by m ethod of injecting culture medium b e neath filtration mem- brane(薄膜过滤反注培养基法检查抑菌药品微生物限度). Chin J Hosp Pharm(中国医院药学杂志)，2005，25(3)：200 ) ( 5 WANG Zhi -jian，(王知坚)， SHAO Hui- qin(邵惠琴)，DU Yun(杜芸)， et al. Experimental study on v a lidation of m i cr o bial limi t tests(药品微生物限度检查法有效性验证实验研究). Chin J ModAppl Pharm(中国现代应用药学)，2004，21(3)：211 ) ( (本文于2007年3月20日修改回) )