加味藿香正气丸中微生物限度检测方案(集菌仪)

Herald ofMedicine Vol. 26 No. 1 January 2007·76· ·77·医药导报2007年1月第26卷第1期 加味藿香正气丸的微生物限度检查 张崇生，申遂扬 (浙江省温州市药品检验所生测室，325028) [摘 要] 目的 建立加味藿香正气丸微生物限度检查的方法。方法 细菌、真菌及酵母菌计数和控制菌检查均采用离心集菌薄膜过滤法进行。结果 加味藿香正气丸对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有明显的抑制作用，回收率<25%，对白念珠菌也有显著的抑制作用，回收率为10.7%。采用离心集菌薄膜过滤法进行微生物限度检查，细菌、真菌及酵母菌计数，5株代表菌株的回收率均>70%；控制菌检查，实验组检出，阴性菌对照组未检出。结论 可用离心集菌薄膜过滤法进行微生物限度检查。 [关键词1加味藿香正气丸；微生物限度检查；验证 [中图分类号] R286：R927. 12 [文献标识码] A [文章编号1 1004-0781(2007)01-0076-02 加味藿香正气丸具有解表化湿，理气和中等功能。临床用于感冒、消化不良，急慢性胃肠炎等属外感风寒，内伤饮食者。具有较强的抗菌作用，特别是对金黄色葡萄球菌，甲、乙副伤寒菌，白念珠菌等菌有较强的抗菌作用。为了保证药品的质量，需要对其无菌情况进行控制。根据《中华人民共和国药典》2005年版的要求，对加味藿香正气丸的微生物限度的检查方法进行了验证。 1 实验材料 1.1培养基 营养肉汤培养基，真菌琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养琼脂培养基，均由中国药品生物制品检定所提供。 1.21菌种 枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大肠埃希菌 [CMCC(B) 44 102]、白念珠菌[CMCC (F) 98 001]黑曲霉[CMCC(B)98 003]. 1.3 样品 加味藿香正气丸，批号20040216，20050312，20050313，生产厂家：广东省罗浮山白鹤制药厂。 1.4 仪器和滤器 HTY-2000A集菌仪，全封闭集菌器，孔径0.45pm过滤膜(杭州泰林)。 2方法与结果 21 菌液制备 ①取经37℃培养18~24 h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1mL+灭菌0.9%氯化纳溶液9mL，10倍稀释至1(10~10°，细菌数为50~100cfu·mL"，做活菌计数备用。②经25℃培养18~24h的白念珠菌真菌液体培养物1mL+灭菌0.9%氯化纳溶液9mL，10倍稀释至107~10°，细菌数为50~100 cfu·mL，做活菌计数备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化纳溶液3~5mL洗下真菌菌子，取1mL，灭菌0.9%氯化纳溶液 9mL，10倍稀释为10，细菌数为50~100cfu·mL，做活菌计数备用。 22 供试液制备 称取样品 10g，加 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液至100mL浓度均为1：10供试液。用匀浆机3000r·min混合均匀，取混匀后后1：10的供试液10mL， 500 ( [收稿日期] 2006-03-29 ) ( [作者简介] 张崇生(1974-)，男，浙江温州人，主管药师，学士， 从事药品检测工作。电话：0577-88538910，Email： wzdazcs@163. com。 ) r·min离心 5 min，再取上清夜 1mL进行薄膜过滤，用 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液冲洗滤膜。 2.3细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证 2.3.1 实验方法 实验组：取混昆后1：10的供试液10mL， 500 r·min 离心5 m in，再取上清夜1mL进行薄膜过滤，用 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入50~100个·mL实验菌株，取下滤膜放置凝固好的琼脂培养基或改良马丁琼脂培养基上，细菌置30~35℃培养48 h观察结果，真菌置23~28℃培养72h观察结果。活菌组：测定每一菌株的实验菌数。供试液对照组：测定供试品本底菌数。稀释液组：取 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液1mL加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，细菌置30~35℃培养48h观察结果，真菌置23~28℃培养 72 h观察结果。 2.3.2 结果 2.3.2.1菌落计数 活菌组菌株在10°稀释浓度时，检测到金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌分别为76和82 cfu·mL；在 10，10°和10°稀释浓度时，分别检测到黑曲霉菌、白念珠菌和大肠埃希菌为57，62，63 cfu·mL。3批次的供试品均没有检测到细菌和真菌。通过常规法直接法检测实验组活菌，结果见表1。稀释液组在10浓度时，检测到金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌分别为75和83 cfu·mL"；在 10，10°和10°稀释浓度时，分别检测到黑曲霉菌，白念珠菌和大肠埃希菌为58，62，65cfu·mL。结果可见，pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液对人工污染的5株代表菌株无抑制作用。 表1常规法直接法检测实验组活菌计数结果 cfu·mL 批号 金黄色 枯草芽 白念 黑曲霉 大肠 葡萄球菌 孢杆菌 珠菌 埃希菌 20040216 15 13 35 26 20050312 17 16 11 38 31 20050313 21 12 9 40 29 2.3.2.2实验组菌落计数结果 每张滤膜每次冲洗50mL，不同量冲洗结果见表2。 2.3.2.3回收率结果 !收率(%)实验组_供试液对照组>×活菌组100%。见表3。从表3结果可以看出，采用离心薄膜过滤法检验加味藿香正气丸供试品，人工污染5株代表菌株，用pH值 7.0氯化钠蛋白胨稀释液冲洗滤膜，每次每张张冲洗50mL，冲洗总量600mL，回收率实验均>70%，可采用离心集菌薄膜过滤法检验。 表22不同冲洗量测定实验组活菌计数 cfu·mL" 批号 每张膜冲洗金黄色葡 ：枯草芽孢 白念 黑曲霉 大肠埃 量/mL 萄球菌 杆菌 珠菌 希菌 20040216 400 37 41 39 55 57 500 49 51 53 54 60 600 67 78 55 56 61 20050312 400 36 39 38 50 54 500 52 49 51 52 59 600 68 71 54 57 60 20050313 400 35 38 36 52 56 500 50 52 51 54 61 600 67 76 53 55 62 表33离心集菌薄膜过滤法测定不同冲洗量与人工染菌的回收率 % 批号 每张膜冲洗金黄色葡 枯草芽孢 白念 黑曲霉 大肠埃 量/mL 萄球菌 杆菌 珠菌 希菌 20040216 400 48.7 50.0 62.9 96.5 90.5 500 64.5 62.2 85.5 94.7 95.2 600 88.2 95.1 88.7 98.2 96.8 20050312 400 47.4 47.6 61.3 87.7 85.7 500 68.4 59.8 82.3 91.2 93.7 600 89.5 86.6 87.1 100.0 95.2 20050313 400 46.1 46.3 58.1 91.2 88.9 500 65.8 63.4 82.3 94.7 96.8 600 88.2 92.7 85.5 96.5 98.4 2.4控制菌检查方法的验证 241 实验方法 实验组：取1：10供试液10 mL，500r·min 离心 5 min，再取上清夜 1 mL进行薄膜过滤，用pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌50~100个·mL"，取下滤膜接至100mL胆盐乳糖培养基中，置35~37℃培养24h，取培养物0.2mL接种至MUG培养基5mL中，于5，24h在波长366mm紫外线下观察，然后进行基质实验。阴性菌对照组：采用金黄色葡萄球菌代替大肠埃希菌，同实验组方法进行检查。 2.4.2 结果 见表4。从表4结果可以看出：离心集菌薄膜过滤方法检验加味藿香正气丸，用pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液冲洗滤膜，每次每张膜冲洗 50 mL，冲洗总量400 mL，实验组检出实验菌，阴性菌对照组未检出，可采用离心集菌薄膜过滤法检验。 25 离心对回收率的影响 2.5.11实验方法 实验组：取500~1000个·mL实验菌株置于 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液9mL中，500 r·min 离心 5 m in，取上清夜摇匀，再取1mL加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，细菌置30~35℃培养48h观察结果，真菌置23~28℃培养72h观察结果。对照组：取500~1000个·mL 实验菌株置于 pH值7.0氯化钠蛋白胨稀释液9mL 中，摇匀，再取1mL加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，细菌置30~35℃培养48 h观察结果，真菌置23~28℃培养72h观察结果。 表4 MUG-I离心集菌薄膜过滤法检查加味藿香正气丸制菌效果 批号 冲洗量/mL 实验组 阴性菌对照组 20040216 0 - 200 -- - 400 ++ 20050312 0 - -- 200 - 一 - 400 ++ 20050313 0 200 400 ++ “+”表示阳性.“"表示阴性 2.5.2 结果 见表55。从表5结果可以看出，离心集菌500r·min 离心 5m in，回收率实验均>70%。 表5 离心对回收率的影响 菌种 菌落计数/(cfu·mL-1) 回收率/ 实验组 对照组 % 金黄色葡萄球菌 97.4 枯草芽孢杆菌 98.9 白念珠菌 59 98.3 黑曲霉 56 100.0 大肠埃希菌 68 94.1 3讨论 加味藿香正气丸具有较强的抗菌作用，特别是对金黄色葡萄球菌，甲、乙副伤寒菌，白念珠菌等菌有较强的抗菌作用。根据《中华人民共和国药典》2005年版的要求，对加味藿香正气丸的微生物限度的检查方法进行了验证，因此其微生物限度检查方法不能采用直接接种法。故采用离心集菌薄膜过滤法，以冲洗量的选择实验作为验证实验2。 阳性对照菌的加入方式，《中华人民共和国药典》2005年版没有明确指出，目前各检验单位采用供试品过滤且冲洗完成后，将菌液直接加入培养基。而在国际调和修正案的微生物限度检查方法中指出在冲洗滤膜的最后阶段，将菌液加入含有少量的冲洗液的滤器中，过滤后再加入培养基，这样就减少了由于滤膜的质量问题而引起的漏检。 集菌经过500r·min离心5 m in，可以除去大部分有抑菌成分的固形物，消除固形物对菌落计数量的影响，其回收率均>70%12] ( [参考文献] ) ( [1] 框 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[Z].北京：化学工 业出版社，2005：附录93. ) ( [2] 汪穗福.微生物检测验证技术[M].北京：中国医药科技出版社， 2005. 1 04-107. ) ( [3 ] 潘友文.现代医药工业微生物实验质量管理与验证技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2004.206-208. ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net