番茄红素脂质体中制备最佳配方和制备工艺检测方案(紫外分光光度)

番茄红素脂质体的制备 田艳燕 段相林 常彦忠 （河北师范大学 河北省动物生理生化与分子生物学重点实验室，河北 石家庄 050016） 摘 要： 目的：制备番茄红素脂质体。方法：采用薄膜-超声法制备番茄红素脂质体，通过剧命运设计法优化出了番茄红素脂质体的组分及制备工艺，应用高效液相色谱法测定番茄红素的含量，用差示扫描量热法检测番茄红素脂质体各组成物质的相变过程。结果：番茄红素脂质体的最佳配方比为：番茄红素：胆固醇：磷脂=3：10：100；最佳水合介质是0.01 mol/L PBS（含0.5%五聚甘油硬脂酸酯）；最适洗膜温度为31 ℃。结论：番茄红素脂质体呈均一大单室型，有效粒径0.7 μm，最大包封率68%。 关键词： 番茄红素；脂质体；均匀设计；差示扫描量热法 番茄红素（Lycopene，LYC）是一种脂溶性天然色素，是类胡萝卜素的一种。其分子式为C40H56，分子量是536.88，含有11个共轭双键和2个非共轭双键碳碳双键。它是非VA前体的类胡萝卜素[1]。番茄红素不溶于水，难溶于甲醇等极性有机溶剂，可溶于乙醚、己烷、丙酮，易溶于氯仿、苯、油脂等，色泽为红色[2]。作为平面共轭多不饱和烯烃，番茄红素具有抗氧化、清除过氧化自由基、防癌抗癌、延缓衰老、上肢心血管疾病的保健功能，其抗氧化性能在类胡萝卜素中最强，清除单线态氧的能力是目前常用的抗氧剂VE的100倍、β-胡萝卜素的2倍多[3-4]。目前已被联合国联农组织（FAO/WHO）联合国食品添加剂委员会（JECFA）认定为A类营养素，被广泛应用于保健食品、医药和化妆品[3]。我们最新的研究证实番茄红素还具有预防脑缺血损伤的作用[5]。番茄红素在加工和贮藏过程中易被氧化降解[3]，进而会影响到产品的保存价值和生物利用率。本实验针对番茄红素在光、热和氧的作用下容易被氧化降解，生物利用率不高等特点，为增加番茄红素的水溶性和提高番茄红素的稳定性，采用旋转薄膜-超声法[5]制备番茄红素脂质体，并对其组分和制备工艺进行了优化。 1 材料与方法 1.1 材料 番茄红素粉末（纯度99%） 华北制药提供；番茄红素标样 Sigma公司；大豆卵磷脂 北京华清美恒公司；胆固醇 北京鼎国生物技术发展中心。 1.2 主要试剂 乙腈（色谱纯） 美国Dikmapure；甲醇、二氯甲烷（色谱纯） 天津科康德；抗氧剂BHT 南京太伟明科公司；吐温-80 天津大茂试剂；五聚甘油硬脂酸酯 山东圣源化学科技有限公司；其他试剂均为分析纯。 1.3 仪器 Ra-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；CPS2超声波粉碎机 宁波新芝超声有限公司；OlympusCK2倒置显微镜 日本Olympus光学公司；JEM100SX透射电子显微镜 日本电子公司；JI-1155型激光散射粒度测定仪 成都精新粉题测试设备公司；液相色谱仪 Amasham公司；TU-1800/1800S型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；热分析系统 美国PE公司，DSC7。 1.4 方法 1.4.1 均匀设计优化番茄红素脂质体的配方 影响因素和水平的确定及实验标的安排，根据预试验并总结有关文献资料，筛选对番茄红素脂质体制备是形成于少杯壁上的类脂薄膜在介质中的分散性能、水合难易程度、脂质体混悬液沉降稳定性等有影响的5种因素：胆固醇与磷脂的质量比（Chol∶PC）、番茄红素与磷脂的质量比（LYC∶PC）、水合介质种类（Vehicle）、水合介质用量（Volume）、有机溶剂挥发温度（Temperature），每个因素选12个水平（拟水平）。根据均匀设计法原理和适用原则，按均匀设计表U12（125）进行拟水平试验，列出实验方案，见表1。 表1 番茄红素脂质体配方均匀设计试验表 实验号 Chol：PC LYC：PC 水和介质种类 水和介质用量/mL 有机溶剂挥发温度/℃ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1.0：10 1.0：10 1.0：10 1.5：10 1.5：10 1.5：10 2.0：10 2.0：10 2.0：10 2.5：10 2.5：10 2.5：10 0.01：1 0.02：1 0.03：1 0.04：1 0.01：1 0.02：1 0.03：1 0.04：1 0.01：1 0.02：1 0.03：1 0.04：1 0.01molPBS+0.5%甘油脂 0.02molPBS+0.5%吐温80 0.01molPBS+0.5%吐温80 0.02molPBS+0.5%甘油脂 0.02molPBS+0.5%吐温80 0.01molPBS+0.5%吐温80 0.02molPBS+0.5%甘油脂 0.01molPBS+0.5%甘油脂 0.01molPBS+0.5%吐温80 0.02molPBS+0.5%甘油脂 0.01molPBS+0.5%甘油脂 0.02molPBS+0.5%吐温80 20 16 12 24 16 12 24 20 12 24 20 16 34 34 34 31 31 31 28 28 28 25 25 25 1.4.2 番茄红素脂质体制备工艺 卵磷脂、胆固醇、番茄红素溶入二氯甲烷中→恒温旋转减压成膜→充氮气约5 min，除去残余溶剂→加入水合介质和玻璃小珠→恒温旋转洗膜形成脂质体混悬液→水浴超声20 min（25 ℃，100 Hz）→探针超声60次（300 Hz，每次5 s，间歇5 s）→即得番茄红素脂质体→充氮气，密闭，4℃保存。 1.4.3 番茄红素脂质体的显微形态观察 将上述脂质体混悬液分别用普通生物显微镜、透射电子显微镜进行观察。透射电子显微镜采用磷钨酸负染法进行，即取1滴待测脂质体混悬液滴于点滴反应瓷板的凹槽内，并将喷碳铜网放在试液上（膜面向下），1～2 min后取出铜网，用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体；按上述方法，将该铜网放在染液滴（4%磷钨酸溶液，pH 7.0）上约30 s，干燥，观察脂质体磷钨酸染色铜网[6]。 1.4.4 脂质体粒度测定 用激光散射粒度测定仪测试番茄红素脂质体的粒径分布结果，测试时用相应的水星介质稀释。 1.4.5 脂质体包封率的测定方法 色谱柱：Amersham RPC C18 (6.4 mm×100 mm,3 mL)， 流动相：甲醇：乙腈：二氯甲烷＝60∶40∶40[7]， 外标：番茄红素 流速：1.5 mL/min，检测波长475 nm，进样量：10 μL。 取0.5 mL番茄红素脂质体于10 mL离心管中，再加入4.5 mL相应的水合介质，混均后离心。离心条件为25 ℃，4000 rpm，25 min。取出上清液，下部为番茄红素结晶沉积，再加入二氯甲烷溶剂，分三次萃取脂质体中的番茄红素，然后进行液相色谱测定，得出脂质体中的番茄红素的含量。 包封率％＝包裹药物量/药物总量×100 1.4.6 差示扫描量热法对脂质体各组分的检测 差示扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC）即DSC曲线，它可以考察脂质体制备过程中物质结构的变化、药物与脂质体的相互作用、表面活性剂对脂质体柔性的影响[8]。 单一组分磷脂形成的脂质体DSC曲线上可以发现两个特征不同的吸热峰。前一个吸热峰形平缓且峰面积较小，来源于磷脂分子中极性端的热运动，磷脂Lβ双层结构转变为Pβ称为预相变。磷脂极性区结合其它分子特别是极性分子会显著影响预相变。后出现的吸热峰称为主相变，峰面积较大，来源于磷脂分子中碳氢链的熔融，结构中含有不饱和键会降低主Tm，增加碳链长度会提高主Tm，同样，结合脂溶物质主要影响主Tm[8]。脂质体中添加不同物质，可诱导脂膜表面产生区块结构，如药物、表面活性剂等有可能影响脂质体膜的Tm变化[7]。本实验DSC检测采用美国PE公司热分析系统，其过程为精确称量各组分于密闭的铝箔中，扫描加热度范围为25～230℃，加热速率为10 ℃/min，充氮速率为15 mL/min[9]。 2 结果与分析 2.1 脂质体制备均匀设计及包封率结果 2.1.1 脂质体制备均匀设计结果 根据表1，对各实验条件下制备的番茄红素脂质体根据包封率大小，进行多元线性回归，设Y为试验结果（即包封率%），n为试验次数（即试验水平数），m为因素数b0、b1、b2、b3、····bm为回归方程的系数，则多元回归方程可表达为： Y=b0+b1X1+b2 X2+b3 X3···+bm Xm 将表中数据采用均匀设计软件2.0进行多元线性回归，求出回归方程及有关的回归参数。自变量个数m=5，试验次数n=12，回归方程为： y=(1.60e+5)-5.85X(1)+(-4.54e+3) X(2)+ (-1.14e+4) X(3)-2.60 X(4)+1.60 X(5) 样本容量N=12，显著性水平α=0.05，检验值Ft=4.541，临界值F（0.05，5，6）=4.387，Ft> F（0.05，5，6），回归方程显著。在均匀设计方案实验范围内，经优化和综合考虑，确定制备番茄红素脂质体的基本条件为：X1=0.1（胆固醇与磷脂重量比），X2=0.03（番茄红与素磷脂重量比），X3=3（水合介质为0.01mol含0.5%五聚甘油硬脂酸酯PBS溶液），X4=20（水和溶剂体积20mL）, X5=34(挥发温度34℃）。如表2所示。 表2 回归方程变量表 序号 X1 X2 X3 X4 X5 Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 2.5 2.5 2.5 0.01 0.02 0.03 0.04 0.01 0.02 0.03 0.04 0.01 0.02 0.03 0.04 2 3 4 1 3 4 1 2 4 1 2 3 20 16 12 24 16 12 24 20 12 24 20 16 34 34 34 31 31 31 28 28 28 25 25 25 68 60 51 39 56 47 40 32 46 31 28 25 2.1.2 包封率测定标准曲线 以乙酸乙酯为溶剂，准确配制为0.1 mg/mL的番茄红素标准贮备溶液，精密量取LYC贮备液0.05、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mL至10.0 mL容量瓶中，加空白脂质体0.1 mL，用流动相稀释至刻度，得浓度范围为0.50～15.0 μg/mL的系列标准液，离心5min（1000 rpm），取10 μL进样。以番茄红素的浓度C对其峰面积比R进行回归，得到标准曲线方程：C=0.2511R-0.0653，γ=0.9996。 2.1.2 回收率和精密度 按照标准曲线操作方法，配制高、中、低三组浓度番茄红素样品液，分别于日内和日间测定峰面积比，依据标准曲线方程换算成实际测得浓度。回收率平均为99.35%，日内RSD为1.15%，日间RSD为1.84%。 2.2 番茄红素脂质体的最佳配方和制备工艺 根据均匀设计结果，称取1 g磷脂、0.1 g胆固醇，加入30mL二氯甲烷中，待完全溶解后将0.03 g番茄红素溶入其中，得类脂溶液。将该类脂溶液置于梨形烧瓶中，用旋转蒸发仪在旋转及减压条件下蒸除有机溶剂，温度为34 ℃，使磷脂等成膜材料在烧瓶壁及玻璃小珠上形成均匀类脂薄膜，再向烧瓶中充氮气10 min，使溶剂完全除去；向烧瓶中加入水合介质（0.01 mol含0.5%五聚甘油硬脂酸酯PBS溶液）20 mL，并在同温度条件下用旋转蒸发仪转动洗膜，待形成的类脂薄膜水和变成牛奶状脂质体混悬液。在将该脂质体混悬液进行水浴超声20 min，然后再用探针式超声粉碎机（300 Hz，工作5 s，间歇5 s）超声分散60次，即得番茄红素脂质体，置棕色瓶中，充氮气，密闭，4 ℃保存。 2.3 番茄红素脂质体显微形态观察结果 普通生物显微镜观察，脂质体轮廓清晰，呈圆球状囊性颗粒（见图1、2）。 透射电镜观察脂质体呈典型单室，其双分子膜规整、均一、连续，呈椭圆形微球体（见图3）。 2.4 脂质体粒径分布结果 用激光散射粒度测定仪测试番茄红素脂质体的粒径分布，结果如图4所示，脂质体的平均粒径为1.12 μm，有效粒径为0.7±0.05 μm。 2.5 差热扫描量热法对脂质体各组分的检测结果 图5~图8是番茄红素脂质体各组分物质经过差热扫描量热法（DSC）检测后的相变过程。从图中可看出卵磷脂的预相变温度是45.20 ℃，胆固醇、卵磷脂、番茄红素的主相变温度分别为148.65、210和174.31 ℃。 图8、9分别是空白脂质体和番茄红素脂质体经过差热扫描量热法检测后的相变过程，如图所示，在空白脂质体（只含有胆固醇、卵磷脂）的DSC曲线上，其主相变温度为98.96℃，而胆固醇、卵磷脂相变峰消失，说明胆固醇和卵磷脂的结构发生了变化，二者的结合致使相变峰有了变化。而在番茄红素脂质体的DSC曲线上其相变峰只有1个，主相变温度为99.62 ℃，说明脂质体中由于番茄红素的加入，磷脂双分子层结构的变化才导致其相变峰和主相变温度发生变化。 2 结论 本文建立了薄膜-超声法制备番茄红素脂质体，通过剧命运设计法优化出了番茄红素脂质体的方法，其中番茄红素脂质体的最佳配方比为：番茄红素：胆固醇：磷脂=3：10：100，最佳水合介质是0.01mol/LPBS（含0.5%五聚甘油硬脂酸酯），最适洗膜温度为31℃，水浴超声20min（100Hz），探针超声60次（300Hz，每次5s，间歇5s），经检测番茄红素脂质体呈均一大单室型，有效粒径0.7μm，最大包封率68%。差示扫描量热法对脂质体各组分的检测结果证明，番茄红素作为脂溶性物质，与脂质体中的磷脂双分子层发生了结合，达到了实验目的，大大提高了番茄红素的生物利用率。 参考文献 [1] Joseph S. Content and isomeric ratio of lycopene in food and human blood plasma[J]. Food Technology,1997,59(3):459～465. [2] DIM,Kaiser S,Sies H. Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher{J}. Arch Biophys,1989,274:532～538. [3] 滕洁，李德芳，刘元军. 番茄红素及其研究进展[J].江苏食品与发酵，2001，104（3）：14～18. [4] 范丽梅.类胡萝卜素的生物学功能[J].生物学通报，2000（4）：10. [5] 常彦忠，段相林. 番茄红素在制药中的应用：CN1615884A[P]. [6] 朱全刚，胡晋红，孙华君等. 来氟米特脂质体的工艺优化[J].华西药学杂志,2000,15(2):85～88. [7] 王会娟，李馨儒，黄燕清等. 番茄红素微囊的体内外药剂学行为[J]. 2005，4099):787～791. [8] 宁美英，郭颖志，顾忠伟. 差热扫描量热法在脂质体研究中的应用[J].国外医学：药学分册，2005，32（1）：56～61. [9] Bhalerao S S，Harshal A R. Preparation, optimization, characterization, and stability studies of salicylic acid lyposomes [J]. Drug Development and Industrial Pharmacy, 2003,29(4):451～467.