草珊瑚中总黄酮稳定性研究检测方案(紫外分光光度)

草珊瑚总黄酮稳定性研究 郁建生 罗显华 （铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300） 摘 要： 以草珊瑚总黄酮含量为指标考察其提取液的稳定性，研究结果表明：乙醇提取法草珊瑚总黄酮稳定性好，提取率高，其提取率是沸水提取法的3.25倍；在八种常见的附加稳定剂中以硫代硫酸钠、亚硫酸钠对总黄酮的稳定性影响较大，可使总黄酮含量降低21.98%～12.07%；草珊瑚提取液中总黄酮含量在存放三年中平均每年降低0.86%，在100 ℃加热30 min后降低0.82%，变化甚微，是非常稳定的；强光直射30 h可使提取液中总黄酮含量平均降低10.27%，对稳定性影响较大；提取液的pH值在4～6时总黄酮含量最稳定。 关键词： 草珊瑚总黄酮； 提取液； 稳定性； 研究 草珊瑚[Sarcanrda glara (Thunb.) Nakai] 有名肿节风、九节茶、接骨金粟兰、接骨木等，系金粟兰科草珊瑚植物，为多年生常绿草本或亚灌木，药、食两用。在我国长江以南各省均有分布，特别是云、贵、川较为多见。草珊瑚叶苦辛、性温、有祛风通络、获取祛瘀、止血止痛、接骨续筋之功效，民间常用来治疗风湿痹症，跌打损伤等[1]及坐茶饮用，已有数百年的历史。 现有的研究表明，总黄酮化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。草珊瑚总黄酮具有抗菌消炎、清热解毒、抗多种肿瘤、促进骨折愈合、改善血液循环、镇痛、抗疲劳、抗氧化、抑制流感病毒等多种生物活性[1-5]。急性毒性试验表明，草珊瑚及其提取物属实际无毒；动物精子畸形试验，小鼠骨髓细胞微核试验等均为阳性，未发现致突变作用，所以是非常安全的[6～7]。目前，草珊瑚加工产品有草珊瑚注射液、草珊瑚口服液、草珊瑚浸膏、草珊瑚含片、草珊瑚片、草珊瑚胶囊、草珊瑚保健茶、草珊瑚奶糖、草珊瑚保健饮料、草珊瑚洗面奶、草珊瑚牙膏、草珊瑚洗发香波等数十种之多[8]。草珊瑚在医药品、保健用品、保健食品领域中的应用越来越广泛，但对草珊瑚总黄酮在不同状态下的稳定性研究尚未见报道。为了更合理的开发利用草珊瑚资源，本研究以草珊瑚总黄酮含量为考察指标，分别考察了提取工艺、稳定剂、加热、pH值、存放时间、光照、温度等因素对草珊瑚总黄酮稳定性的影响，研究保持草珊瑚总黄酮稳定性的各种最佳条件因素，从而为生产中最有效地开发利用草珊瑚总黄酮、发挥草珊瑚的最大经济效益提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与设备 试验用草珊瑚全草均来自贵州省江口县梵净山岳同一地点，由铜仁职业技术学院重点实验室进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样，避免背景干扰。 所用试剂NaNO3、Al（NO3）3、NaHSO3、EDTA、吐温-80等均为分析纯；标准品芦丁（纯度大于98％） 美国Sigma公司；乙醇为95％食用酒精。 TU-1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司； RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣；不锈钢提取锅 武汉立中；PHSJ-3F精密酸度计 上海雷磁；ALG5/10自动灌装封口机 上海国彩；电子天平 美国奥豪斯。 1.2 方法 1.2.1 草珊瑚总黄酮的测定方法 草珊瑚总黄酮的测定方法采用芦丁比色法[9]，测定波长500 nm，回归方程为：C ＝ 84.317A-0.77361（相关系数γ＝0.9997）；加样回收的平均回收率99.37％，RSD1.85％（n＝6）；精密度测定RSD 0.85％。 1.2.2 草珊瑚总黄酮的沸水提取法 取草珊瑚全株（除根）干品粗粉50 g，根据L9（34）正交设计沸水提取筛选出最优水平组合A3B3C2D1进行提取（即采用100 ℃温度、加水量（固液比）10倍）、每次1 h，提取2次）。合并提取液过滤，滤液浓缩至糖浆状时止，搅拌加入 95％乙醇至含醇量达65％以上，以沉淀除去蛋白质、淀粉、脂肪、多糖等，过滤除去沉淀，减压回收乙醇，趁热过滤，加等量水定容，并调节pH 5～7后冷藏静置过滤，得总黄酮粗提液，过AB-8型大孔吸附树脂柱分离纯化，过柱完后用60%乙醇洗脱，减压回收乙醇，过滤，按一定百分浓度用蒸馏水溶解定容，得总黄酮提取液，按1.2.1方法进行测定。 1.2.3 草珊瑚总黄酮的乙醇提取法 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉50 g，根据L9（34）正交设计沸水提取筛选出最优水平组合A1B3C3D3进行提取（即采用10倍量60%乙醇、80 ℃温度、每次3 h，提取3次）。提取后合并醇提液过滤，减压回收乙醇，趁热过滤，加等量水定容，并调节pH 5～7后冷藏静置过滤，得总黄酮粗提液，过AB-8型大孔吸附树脂柱分离纯化，过柱完后用60%乙醇洗脱，减压回收乙醇，过滤，按一定百分浓度用蒸馏水溶解定容，得总黄酮提取液，按1.2.1方法进行测定。 2 结果与分析 2.1 提取工艺对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（表1） 表1 提取工艺对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 沸水提取法 总黄酮含量/（µg/mL） 提取率/％ 总黄酮含量/（µg/mL） 提取率％ 22.683 2.13 55.432 6.93 对比表1中两种不同的提取方法可知，乙醇提取法草珊瑚总黄酮稳定性好，提取率高；沸水提取法草珊瑚总黄酮稳定性差，提取率低；乙醇提取法对草珊瑚总黄酮的提取率是沸水提取法的3.36倍。 2.2 不同稳定剂对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉，按1.2.3制成总黄酮提取液，取8份，分别加入不同的稳定剂（加入量EDTA和吐温-80为0.1％，其余均为0.2％）后100 ℃灭菌30 min，按1.2.1方法进行测定，结果见表2。 表2 不同稳定剂对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 稳定剂 VC 偏重亚硫酸钠 亚硫酸氢钠 亚硫酸钠 硫代硫酸钠 EDTA 吐温-80 未加 颜色 pH值 总黄酮含量/（μg/mL） 浅棕红 5.22 18.96 浅棕红 5.73 18.62 浅棕红 5.59 18.79 浅棕红 6.31 16.43 棕红 5.97 14.49 棕红 5.93 18.62 棕红 5.99 18.70 棕红 6.09 18.69 2.3 加热对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉，按1.2.3制成总黄酮提取液，取3份，100 ℃加热30 min，按1.2.1方法进行测定，加热前后总黄酮稳定性变化见表3。 表3 加热对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 样品 总黄酮含量/（μg/mL） 加热前 加热后 20050106 20050208 20050310 平均值 36.564 40.106 46.514 41.062 36.226 39.60 46.344 40.724 从表3可见，加热后3批样品总黄酮含量平均下降0.338 μg/mL，占总量的0.82％，变化小是非常稳定的。 2.4 不同pH值对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉3份，按1.2.3制成总黄酮提取液，各取8份，分别用NaOH及10％H2SO4调不同的pH值，100 ℃加热30 min，按1.2.1方法进行测定，结果见表4及图1。 表4 不同pH值对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） pH 2.9 3.9 4.9 5.9 6.9 7.9 8.9 9.9 未调 样1 样2 样3 18.113 21.832 20.543 20.896 23.977 22.434 21.084 24.543 23.415 22.414 25.667 24.657 18.788 21.685 21.125 18.125 20.875 20.474 16.511 19.136 18.847 14.570 17.294 16.943 22.112 24.985 24.258 表4结果表明，3批提取液的pH值均在4～6时总黄酮含量最高最稳定。 2.5 自然存放时间对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉3份，按1.2.3制成总黄酮提取液，装入玻璃器皿中密封， 100 ℃加热灭菌，在自然条件下存放三年，按1.2.1方法定期对草珊瑚总黄酮进行测定，其稳定性变化见表5。 表5 自然存放时间对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） 时间 200104 200404 200304 200404 样品20010126 20010230 20010401 均值 33.483 17.776 31.267 28.175 35.314 17.607 31.014 27.978 35.061 17.439 30.677 27.726 34.724 17.186 30.424 27.445 从表5可见，三批提取液样品从2001年4月到2004年4月，在存放三年过程中总黄酮含量平均每年降低0.243 µg/mL，占总量的0.86％，所以比较稳定，变化小。 2.6 光照对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉3份，按1.2.3制成总黄酮提取液，装入玻璃器皿中密封， 100 ℃加热30min灭菌，分别在无光照下存放一年，室内光放置30 d，强光下放置10、30 h，按1.2.1方法定期对草珊瑚总黄酮进行测定，观察其稳定性，结果见表6。 表6 光照对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） 样品 0光照 无光照1年 室内光30 d 强光10 h 强光30 h 20030201 20030202 20030203 均值 21.467 19.484 19.157 20.036 21.253 19.329 18.993 19.892 20.980 19.041 18.451 19.491 20.310 18.451 17.860 18.874 19.462 17.439 16.764 17.888 从表6可知，三批提取液样品无光照存放1年总黄酮含量平均下降0.72％；室内光放置30 d后平均下降2.72％；受强光照射10 h后平均下降5.80％，强光照射10 h后平均下降10.72％；强光照射对总黄酮稳定性的影响较大，在存放时应避免强光照射。 2.7 温度对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉3份，按1.2.3制成总黄酮提取液，装入玻璃器皿中密封， 100℃加热灭菌，分别在不同温度下存放，按1.2.1方法定期对草珊瑚总黄酮进行测定，观察其稳定性，结果见表7。 表7 温度对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） 样品 灭菌后室温存放（d） 0 30 60 180 360 31202 31204 31206 均值 48.762 46.583 48.421 47.922 48.760 46.583 48.418 48.750 46.572 48.411 48.681 46.495 48.310 48.288 46.225 48.096 47.922 样品 灭菌后37～40 ℃存放（d） 0 15 30 60 180 31202 31204 31206 均值 48.762 46.583 48.421 47.922 48.762 46.581 48.420 48.751 46.570 48.409 48.705 46.513 48.364 48.412 46.226 48.101 47.580 样品 灭菌后2～4存放（d） 0 15 30 600 180 31202 31204 31206 均值 48.762 46.583 48.421 47.922 48.760 46.581 48.419 48.755 46.576 48.410 48.729 46.537 48356 48.288 46.093 48892 47.424 表7表明，灭菌后室温存放一年总黄酮含量平均下降0.81％；在37～40 ℃存放180 d总黄酮含量平均下降0.71％；在2～4 ℃存放180 d总黄酮含量平均下降1.04％；室温存放对草珊瑚总黄酮稳定性影响小，其产品完全可以室温下存放。 3 结论与讨论 3.1 L9（34）正交设计筛选出沸水提取最优水平组合（即100℃温度、加水量（固液比）10倍）、每次1h，提取2次）以及乙醇浸提最优水平组合（即10倍量60%乙醇、80 ℃温度、每次3 h，提取3次）对草珊瑚总黄酮进行提取并通过AB-8型大孔吸附树脂柱分离纯化，比较两种提取工艺对草珊瑚总黄酮稳定性的影响。结果表明，乙醇提取法草珊瑚总黄酮稳定性好，提取率高，其提取率是沸水提取法的3.25倍。 3.2 在天然植物提取液中，常常加入抗氧机及金属络合物等附加剂以防止和延缓有效成分的氧化分解，加入助溶剂以增加提取液的澄明度。而这些附加剂的加入既要保护提取液中天然活性成分不受氧化分解，又不要影响提取液的稳定性、澄明度和活性作用。试验表明，硫代硫酸钠、亚硫酸钠对草珊瑚总黄酮的稳定性影响较大，可使总黄酮含量降低21.98%~12.07%，在生产中应避免使用。而VC、偏重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、吐温-80等对草珊瑚总黄酮的稳定性影响小，均可选用，加入抗氧剂后并可使提取液的颜色浅淡而改善提取液的澄明度。但VC、偏重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等偏弱酸性，对提取液pH值有不同程度的影响，在生产中应注意调整。 3.3 在草珊瑚注射液、口服液等加工生产中，常常需要加热灭菌以有利于产品的长时间保存，三批提取液在100 ℃加热30 min灭菌后，总黄酮含量平均下降0.338 μg/mL，占总量的0.82%；所以草珊瑚总黄酮在100 ℃加热30 min是比较稳定的，含量变化小，此举有利于草珊瑚产品的灭菌保存。 3.4 在草珊瑚总黄酮的提取生产中，pH值总是总黄酮质量稳定性的一项重要指标，对总黄酮的稳定性影响较大。试验表明，提取液的pH值在4~6时总黄酮含量高，最稳定。 3.5 对自然存放时间不同的草珊瑚提取液考察表明，三批提取液样品从2001年4月到2004年4月存放三年过程中总黄酮含量平均下降0.243 µg/mL，占总量的0.86%，所以比较稳定，变化小。 3.6 黄酮类化合物是广泛存在于植物中的一类黄色色素，因分子中含有碱性氧原子能与酸结合成盐，又称黄碱素。而色素受光照影响较大。试验表明，三批提取液样品受室内散射光照射30 d后，总黄酮含量平均下降2.72%，强光照射10h平均下降5.80%，强光照射30 h平均下降10.72%。说明强光照射对草珊瑚总黄酮稳定性影响大，可使总黄酮分解含量降低，所以在保存使用中应避免强光长时间直射。 3.7 草珊瑚总黄酮在不同温度下存放的试验结果表明，灭菌后室温存放一年总黄酮含量平均下降0.81%，在37～40 ℃存放180d总黄酮含量平均下降0.71%，在2～4 ℃存放180 d总黄酮含量平均下降1.04%，室温存放对草珊瑚总黄酮稳定性影响小，其产品完全可以在室温下存放。 参考文献 [1] 江苏医学院. 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