桂枝中肉桂酸检测方案(毛细管电泳仪)

广西工学院学报JOURNAL OF GUANGXI UNIVERSITY OF TECHNOLOGYVol.15 No.4Dec. 2004第15卷第4期2004年12月 2004年12月广西工学院学报2 文章编号 1004-6410(2004)04-0001-04 非水相毛细管电泳一紫外检测法的应用研究 ——桂枝中肉桂酸的测定 李利军1，黄文艺?，孔红星1，程 昊2，吴健玲? (1.广西工学院生物与化学工程系，广西柳州 545006；2.广西大学化学与化学工程学院，广西南宁 530005) 摘 要：利用非水体系毛细管电泳一紫外检测法对肉桂酸进行分离与测定，建立了肉桂酸测定的新方法，并研究了非水介质、电解质、运行电压等分离因素对该方法的影响。在25℃下，用未涂层石英毛细管(45 cm×75 um，有效长度为 30 cm)，以 20 mmol/L 乙酸铵+30 mmol/L乙酸钠的乙醇溶液为电泳缓冲介质，重力进样30 s，运行电压为-25KV，检测波长为 271 nm，测定肉桂酸。以吸收峰的峰面积定量，制作标准工作曲线，其线性范围为4.00~80.00 mg/L，相关系数r=0.9997。应用于桂枝中肉桂酸的分离测定，结果较为满意。 关 键 词：非水相体系；毛细管电泳；紫外检测；肉桂酸；桂枝 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 0 前言 桂枝为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝，主产于广西、广东、云南，具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气的药用功效。但不同的产地，桂枝中肉桂酸的含量相差很大，其药用效果会有很大的差别。目前，桂枝的质量控制主要根据性状、显微鉴别、理化反应及薄层色谱来完成。桂枝的质量评价、商品等级划分仍沿袭传统评价方法，以色泽、香气、老嫩来划分21。因此，建立一种对桂枝的科学的质量评价的新方法是必要的。 肉桂酸(cinnamic acid)，又称桂皮酸，是桂枝的主要活性成分之一，测定桂枝中肉桂酸含量在桂枝的质量评价中起着关键的作用。目前肉桂酸的测定方法有极谱法[3.4]、薄层扫描法、高效液相色谱法6.73.高效液相色谱法是应用较多的方法，但这些方法分析时间长，操作繁琐。毛细管电法法作为一种新的高效分离分析技术，也开始应用于肉桂酸的分离与测定，但都是采用水相介质。由于肉桂酸在水介质中溶解度小，容易堵塞毛细管或被毛细管的内壁吸附，使用胶束虽然可以增加其溶解度，但容易产生气泡，影响测定的重复性和准确度，同时为避免中药中其它有机成份的干扰而必须进行繁琐的前处理。 非水体系毛细管电泳法是近年发展起来并逐渐引起人们注意的毛细管电泳法的一个分支~11]。它具有许多水相体系不具有的优点：①拓宽分析领域，在水中难溶的各类化合物，如有机烃类分子、某些药物分子和生物分子能在有机介质中有较高的溶解度而实现分离1101；②增加优化参数，如有机介质的极性、介电常数、粘度等，可提高选择性和灵敏度[12~14]；③可承受较高的操作电压，有较高的分离效率1，尤其适合在水相介质中溶解度小的物质。肉桂酸在水介质中溶解度小，本文采用了非水体系毛细管电泳法对肉桂酸进行分离测定，以无水乙醇为溶剂，样品处理方法简单，工作电流低，其它成分干扰小，避免了用水相测定时，样品中不易溶于水的有机物过多吸附甚至堵塞毛细管的缺点，基线稳定，噪音小，峰型好。 试验部分 ( 收稿日期：2004-09-18 ) ( 基金项目：广西教育厅科研基金资助项目(2000392). ) ( 作者简介：李利军(1966-)，湖北黄梅县人，广西工学院副院长，教授，理学博士。 ) 1.1 主要仪器和试剂 仪器：ACS2000 型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，负电源：电压0~30 KV可调，毛细管 75 um，总长 45 cm，有效长度30 cm，检测波长 271 nm；UV-2102PC型紫外可见分光光度计(UNICOinstruments CO. ，LTD)；DL-60D 超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。 主要试剂：无水乙醇(≥99.7%，分析纯)，乙酸铵(≥99.0%，分析纯)，肉桂酸(≥99.5%，分析纯)，乙酸钠(≥99.0%，分析纯)，水(二次蒸馏水)。 肉桂酸标准溶液制备：准确称取0.1000g肉桂酸，置于50 ml的容量瓶，用乙醇定容，制成2000 mg/L的标准贮备液。取2000 mg/L 的标准贮备液4 ml 置于50ml容量瓶中，用乙醇定容，制成 160 mg/L 的标准溶液。 试样及处理方法：将桂枝(产地：广西桂林)置于恒温烘箱内，在60℃的恒温下烘烤12h，然后研磨成粉状，精确称取取枝粉5.0 g，用30 ml无水乙醇浸泡24h后用超声波振荡 30 min，砂芯漏斗过滤，残渣加入适量的无水乙醇并用超声波振荡30 min 后过滤，合并滤液，再用无水乙醇定容至50 m，制成提取液。 1.2 试验条件 电压：-25 kv；进样方式：重力进样；进样高度：12.5cm；进样时间：30s；检测波长271 nm；环境温度：25℃。 1.3 试验操作 毛细管的处理：每天实验前依次用1 mol/L NaOH 水溶液、二次蒸馏水、无水乙醇分别冲冼5 min，每次进样前用缓冲液冲洗 5 min。实验结束后依次用无水乙醇、二次蒸馏水冲洗后用 0.1 mol/L NaOH 水溶液浸泡过夜。实验所有的溶液进柱前均用 0.45 um 的滤膜过滤，并经超声波脱气。 2 实验结果与讨论 2.1 分离条件选择 2.1.1 缓冲溶液 在非水毛细管电泳中，选择适当的有机溶剂是实现有效分离的关键。甲醇、丙酮、吡啶由于挥发性大，实验的重现性差；而在甲酰胺体系中电泳电流比较大，基线噪音大。乙醇的挥发性较小，无毒性，紫外吸收弱，而且对大多数有机物有极好的溶解能力，实验结果表明，乙醇作为电泳介质，效果较好。但乙醇的导电能力弱，因此需添加电解质使电泳介质有一定的导电能力。乙酸钠和乙酸铵在紫外区的吸收都比较弱。试验考察乙酸铵和乙酸钠两种电解质，发现单独用乙酸钠作电解质时基线稳定且噪音小，但分析时间长，增加浓度(20~50 mmol/L)可缩短分析时间，但浓度增大，毛细管容易堵塞，可能是由于乙酸钠容易析出而吸附于毛细管内壁的原故；只用乙酸铵作电解质进行试验时，发现它的检测信号更强，但基线稳定性和保留时间重现性不好。因此选用一定比例的乙酸钠和乙酸铵作为电解质进行试验，结果表明，电流的大小随着总浓度的增加而增大，但电流增大，焦耳热效应大。在50 mmol/L电解质浓度下，分别考察了乙酸铵与乙酸钠的比例为：10：40，20：30，25：25，40：10时的情况，发现它们都有较稳定的基线且噪音小，其中以20：30这一比例的分析时间最短。因此，本实验选用20 mmol/L 乙酸铵十30 mmol/L 乙酸钠的乙醇溶液作为电泳缓冲介质。 2.1.2 检测波长的选择 以无水乙醇作参比液，对 16 mg/L 肉桂酸的无水乙醇溶液在190~400 nm 波长之间进行扫描，得到紫外谱图(如图1)。由图1可知，肉桂酸在乙醇中的最大吸收波长为 271 nm，本试验选用271nm 为检测波长。 2.1.3分离电压的选择 分离电压对分析速度和分离效果均有影响。分别考察了电压为15~30KV时的试验效果，发现电压低时，基线稳定，但样品的分析时间长，峰形宽；随着电压的增加，样品的保留时间缩短，峰形窄，分离效果好，但基线的稳定性略有下降，基线噪音增大。为保证较短的分离时间和较好基线，本试验选用25 KV 作为分离电压。 2.2 工作曲线的制定 准确移取浓度为 160 mg/L 的肉桂酸标准溶液0.25、0.5、1.0、2.5、3.75、5mL，分别置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，配成不同浓度的肉桂酸溶液。按上述的试验方法，测定不同浓度的峰高，由峰高(Y)与浓度 (X)制作工作曲线(见图2)，线性方程为： Y=0.2824X+0.3178(线性范围：4.00~80.00 mg/L)，相关系数：R=0.9997。对50 mg/L的标准肉桂酸乙醇溶液平行测定5次，其相对标准偏差(RSD)为2.0%。按信噪S/N=3计算，检出限为 1.814 mg/L。 <2.5 图1 16 mg/L肉桂酸的乙醇溶液紫外谱图 图2 工作曲线图 2.3 样品的测定 准确量取桂枝提取液 5.0 mL 置于10 mL的容量瓶中，用乙醇定容，制成样品溶液。样品溶液用0.45um 的滤膜过滤，并经超声波脱气后用于测定。在上述条件下测定样品溶液中肉桂酸的含量，由肉桂酸吸收峰的峰面积与浓度的线性方程计算，桂枝中肉桂 酸的含量为0.502 mg/g。标准样品电泳图见图3. 桂枝提取液电泳图见图4. 2.4 回收率的测定 往5.0 mL的桂枝提取液中分别加人不同量的肉桂酸，用乙醇定容后，用本法进行回收率试验，结果如表1。由表1可知，测定桂枝中肉桂酸的相对标准偏差(RSD)为 2.4%；加标回收率在98%~103.9%之间，相对标准偏差(RSD)低于3.2%。 3 结论 图3 标准肉桂酸电泳图 图4 桂枝提取液电泳图 试验表明，以20 mmol/L 乙酸铵十30 mmol/L乙酸钠的乙醇溶液为电泳缓冲介质，工作电流低，其它成分干扰小，避免了用水相测定时，样品中不易溶于水的有机物过多吸附甚至堵塞毛细管的缺点，基线稳定，噪音小，峰型好，而且样品处理方法简单，试样与试剂用量小。试验结果表明，该法具有较好的精密度和准确度，可应用于桂枝中肉桂酸的测定。 表1 回收率试验结果(n=5) 提取液测定值 RSD 加标量 加标后测定值 RSD 回收率 (mg/L) (%) (mg/L) (mg/L) (%) (%) 20.80 46.73 3.2 103.9 25.10 2.4 24.00 49.36 0.64 101.1 28.80 53.35 3.1 98.0 ( [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2000. ) ( [2]南京药学院药材教研组药材学[M].南京：人民卫生出版社，1977. ) ( [3]李丽敏.线性扫描极谱法测定微量测桂酸[J].理化检验(化学分册)，2003，38(6)：295-296. ) ( [4]王 伟，宋俊峰，李焕妮，等.肉桂中肉桂酸的单扫描示波极谱法测定[J].药物分析杂志，1995，15(4)：3-5. ) ( [5]张 玲，徐本明.双波长薄层扫描法测定肉桂酸的含量[J].药物分析杂志，1997，17(6)：408-410. ) ( [6]解希田.高效液相色谱法测定桂龙咳喘宁胶囊中肉桂酸含量[J].山东中医药大学学报，2003，27(3)：221-221. ) ( [7]余明艳，汪水娟.反相高效液相色谱法测定脉络宁注射液中肉桂酸的含量[J].中国中药杂志，2000，25(7)：415-417. ) ( [8]李 蓓，车镇涛，郭济贤.胶束电动毛细管电泳色谱法法定苏合香和枫香脂中总桂皮酸的含量[J].上海医科大学学报， 1999，26(5)：380-381. ) ( [9]徐木生，王小如，杨芃原，等.非水介质毛细管电泳[J].色谱，1998，16(4)：309-313. ) ( [ 1 0] Leung GN W，T a ng H P O，Tso T S C et al. 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Studied were the effects of separatingfactors such as non-aqueous medium，electrolyte and notion voltage on the method. Under the temperature of25℃ the cinnamic acid was determined by using the last coat quartz capillary (45 cm×75 um，effective length30 cm)，and using the ethanol solution containing 20 mmoI/L ammonium acetate and 30 mmoI/L sodiumacetate as electrophoresis buffer medium. And gravitational laying sample is 30 s，motion voltage -25 KV anddetecting wave length 271 cm. The standard working curves were made by fixed quantity of the peak area ofabsorbing peaks，and its linear range is 4. 00~80.00 mg/L，the correlation coefficient is r=0. 9997. The methodis of good results when it is applied to separating and detecting cinnamic acid in the cassia twig. Key words：non-aqueous system；capillary electrophoresis；ultravoilet detection；cinnamic acid；cassia twig ( (责任编辑 赖君荣) ) 数据