AN116 药物中阴离子定量分析检测方案(离子色谱仪)

阴离子Dionex 应用注解 AN116 药物中阴离子的定量分析 引言 美国食品药品安全局(FDA)和其他国家的法规制定机构都要求对药物组分进行检测，以检验其均一性、药效、质量及纯度等，并且越来越注意其活性和非活性成分。既能够检测生色成分又能够检测非生色成分的分析技术是非常有价值的。其中，非生色成分中有很多是离子型的，不能用吸光度法检测，但可以用抑制电导法检测。抑制电导是一种有效的检测技术，线性范围宽，检测限低。抑制器可以降低淋洗液的背景电导，并有效提高分析物的检测电导。 本文使用两种阴离子交换柱和抑制电导检测法来分析药物中的常见阴离子。选择两种口服药物作为代表： -种咳嗽药， -种感冒药。其组分包含糖醇、乙二醇和糖类，可以用IonPac@ICE-AS1， CarboPacTMMA1， 和CarboPac PA10色谱柱用电化学检测器分析。 本文比较了IonPac AS14 和AS11色谱柱对药物中阴离子的选择性。AS14填料采用高度交联的基核，表面有阴离子交换层。阴离子交换层可以与烷基季胺盐结合，对憎水基团具有选择性。而AS11填料是在聚乙基苯乙烯表面结合烷基季胺盐。另外一个不同点是AS14色谱柱适用于等度淋洗条件，而AS11可以用氢氧化物梯度淋洗。两种色谱柱都可以使用有机溶剂淋洗液，以减少某些有机阴离子与固定相的二级反应。AS11色谱柱的检测限、线性、选择性、准确度以及精密度已有报道。 仪器设备 Dionex DX-500系统，包括GP40梯度泵(含排气)； CD20 电导检测器或ED40电化学检测器； LC30 或LC25恒温箱或LC20； AS3500 自动进样器 PeakNet 色谱工作站 试剂及标准 试剂： 碳酸钠， Sodium carbonate， 0.5 M (Dionex P/N 37162) 碳酸氢钠， 0.5 M (Dionex P/N 37163) 氢氧化钠， 50%(w/w) (Fisher Scientific，P/N SS254-500) 去离子水，18MQ-cm或者以上(建议事先检测) 标准： 五种阴离子标准(氟离子、氯离子、硝酸根、磷酸根、硫酸根， Dionex P/N37157) 无水乙酸钠， (Fluka Biochemika， P/N 71179) 溴化钠， (Aldrich Chemical Co.， lP/N 31，050-6) 氯化钠， (Fisher Scientific， P/N S271-500) 一水合柠檬酸钠， (Fisher Scientific， P/N A104-500) 安息香酸钠， ( Sigma Chemical Co.， P/NB-3375) 糖精(邻磺酰苯甲酰亚胺)， (Sodium salt； Sigma Chemical Co.， P/N S-1002)条件 体系1： 色谱柱： IonPac AS14 分析柱 (P/N 46124)，IonPac AG14 保护柱(P/N 46134) 淋洗液：：33.5mM碳酸钠+0.8mM 碳酸氢钠 流速： 1.2 mL/min 进样体积：10uL 检测模莫：抑制电导ASRSTM， 期望背景值：：15pS 期望操作反压：： 12.4 MPa (1800 psi) 体系2： 色谱柱： IonPac AS11分析柱(P/N 44076)， IonPac AG11保护柱 (P/N 44078)， ATC-1Anion 捕获柱 (P/N37151) 淋洗液：氢氧化钠梯度淋洗 时间 / min ： 0~2.5 2.5~~6 6~~18 18~25 浓度/mM： 0.5 0.5~~5 5~~38 0.5 流速： 2ml/min 进样量：：10pl 检测模式：抑制电导ASRS，5，E自循环模式 期望背景值：0.5 uS 期望操作反压：12.4MPa (1800 psi) 溶液配制 3.5mM碳酸盐/0.8mM碳酸氢盐淋洗液： 将1980ml去离子水、14.0ml0.5N碳酸盐和3.2ml0.5N碳酸氢盐溶液混合，除气20min。 5mM氢氧化钠溶液：用1990ml除气的去离子水稀释10.4ml50%(w/w)氢氧化钠溶液。 标准液：将五种阴离子标准(氟离子、氯离子、硝酸根、磷酸根、硫酸根， Dionex P/N37157)以及醋酸盐、溴化物、柠檬酸盐、苯甲酸盐和邻磺酰苯甲酰亚胺用纯化水配制： 离子浓度mg/1离子浓度 mg/1氟离子 1.6磷酸根12醋酸根 9.8氯离子2.4硝酸根 8.0柠檬酸盐10溴离子 9.8苯甲酸盐10 样品....... 硫酸根112.0 邻磺酰苯甲亚亚100 将粘稠的样品用水稀释10倍(w/w)，多效感冒药稀释100倍。以密度计算浓度，其成分列于表1和表2。表中的黑体成份可以用阴离子交换柱和抑制电导检测，其余的可以用CarboPac柱分离并电化学检测。 需要测试稀释用的水中痕量阴离子的含量；需要测试样品容器中的残留阴离子。一般塑料制品比玻璃制品残留阴离子低。用纯水清洗可以减少残留。 表1咳嗽药 Dextromethorphan Hydrobromide 活性 Citric Acid 非活性 FD&C Red 40 非活性 Flavors 非活性 Glycerin (glycerol) 非活性 Propylene Glycol 非活性 Saccharin Sodium 非活性 Sodium Benzoate 非活性 Sorbitol 非活性 Water 非活性 表2多效感冒药 Pseudoephedrine Hydrochloride 活性 Acetaminophen 活性 Dextromethorphan Hydrobromide 活性 Citric Acid 非活性 FD&C Yellow #6 非活性 Flavor 非活性 Glycerin (glycerol) 非活性 Polyethylene Glycol 非活性 Propylene Glycol 非活性 Purified Water 非活性 Saccharin Sodium 非活性 Sodium Citrate 非活性 Sucrose 非活性 结果和讨论 选择性 图1是氟离子、醋酸根、氯离子、硝酸根、磷酸根、硫酸根的分离色谱图，使用IonPac AS14柱，3.5mM碳酸钠/0.8mM碳酸氢盐淋洗。这种等度淋洗条件不需要平衡柱子，因而缩短了运行时间并提高了工作量，可以在14分钟内分析完。柠檬酸盐、苯甲酸盐和邻磺酰苯甲酰亚胺不用这种方法淋洗。 使用IonPac AS11柱，氢氧化钠梯度淋洗，分离无机离子、醋酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐和邻磺酰苯甲酰亚胺(见图2)，尽管梯度淋洗增加了时间，但是有机物和无机阴离子的分离度很好；如果调节淋洗液强度，即使缩短了分离时间，但是牺牲了氟离子和醋酸根之间的分离度。 邻磺酰苯甲酰亚胺一次进样超过1000ng时会大大缩短保留时间，从而产生与柠檬酸盐的共淋洗，此时，二者的浓度在10uL进样时都要调至100mg/L以下。邻磺酰苯甲酰亚胺峰会拖尾，可以在淋洗液中加入有机溶剂(例如，10%乙腈)。加入乙腈会改变柱子的选择性，降低峰面积，增大噪音。 已经使用IonPac AS14和AS11柱和抑制电导分析了很多的药物(包括固体和液体样品)如鼻子和口腔的抑制剂，收敛剂，抗酸剂，灌肠剂，安眠药，镇痛药，清洁洗剂，抗组胺剂，过敏糖浆等。其中的已知阴离子互相没有干扰。 图1阴离子的分离 图2分离有机物和无机离子 检测限 用AS11柱10uL进样的检测限(MDL)列于表3，检测限定为信噪比为3时的浓度。通过使用外接水模式，增加进样量，可以降低检测限。 表3检测限 体系2(IonPac AS11柱) ng g/L 氟离子 醋酸根 氯离子 溴离子 硝酸根 硫酸根 磷酸根 柠檬酸盐苯甲酸盐 邻磺酰苯甲酰亚胺 0.3 2 0.5 43 14 4 7 20 30 200 50 400 300 100 400 400 700 2000 线性关系 氯离子、溴离子、柠檬酸盐和邻磺酰苯甲酰亚胺在1~1000mg/L(进样量10~10000ng)范围内线性良好(r2=0.999)；苯甲酸盐在1~200mg/L(r2=0.999)呈线性(在1~1000mg/L范围内线性系数为0.995)；柠檬酸盐和邻磺酰苯甲酰亚胺单独进样时线性良好，但浓度在100mg/L以上时会产生共淋洗，因此如果两个化合物都在高浓度下不能呈良好线性。分析物的线性一般需要跨两个数量级。AS14和AS11柱的线性见图3和图4。 图3IonPac AS14柱等度淋洗线性图 图4IonPac AS11柱梯度淋洗线性图 精密度 使用IonPac AS11柱分离的峰面积和保留时间的RSD见表4。峰面积的精密度受浓度的影响，浓度接近检测限，精密度上升。 重复十次10pL进样，稀释10倍的咳嗽药溶液中溴离子(30n g/mL)的峰面积RSD是0.5%；而稀释100倍的多效感冒药中溴离子(1ng/mL)的峰面积RSD是1.0%，氯离子(1ug/mL)的峰面积RSD是0.3%。保留时间的RSD从0.1%到0.2%。(见表5) 表4峰面积和保留时间的精密度* RSD% 峰面积 保留时间 氯离子 溴离子 苯甲酸盐 柠檬酸盐 邻磺酰苯甲酰亚胺 0.1 0.10.20.3 0.4 0.2 0.1 0.1 0.4 0.3 *100mg/l标准，10uL进样(n=15) 表5药品中离子峰面积和保留时间的精密度* RSD% 测得浓度 咳嗽药 感冒药 溴离子溴离子氯离子 30 1 3 0.5 1.00.3 *咳嗽药稀释10倍，感冒药稀释100倍，10uL进样(n=10) 样品基体的回收率 图5和图6是使用AS14和AS11柱分离咳嗽药中溴离子的色谱图；图7和图8是分离感冒药中溴离子和氯离子的色谱图。溴离子是药物中的有效成分美沙芬的溴化氢盐的对离子，氯离子是盐酸假麻黄碱的对离子，所以这两种阴离子直接反映了其对应物的含量。其检测含量与标明的有效成分含量的比值见表6，其误差在10%以内。 药品中的无效成分一般没有标明，但是图6和图8也对其进行了定量。 表 6药品中有效成分的回收率 美沙芬溴化氢盐 假麻黄碱盐酸盐 咳嗽药感冒药 98.9%97.3% 109% 药品中其他的阴离子 在药品生产过程中使用的原料可能会引进其他的阴离子，放大基线可以看到它们的存在(见图6B和图8B)。其中硫酸根(2ug/mL)和磷酸根(1ug/mL)在咳嗽药中被检测到；硫酸根(13ng/mL)在感冒药中也可以检测；但是其他的阴离子没有得到确认。 结论 使用IonPac AS11柱，抑制电导可以分析药品中的有机物和无机阴离子，例如氟离子、氯离子、溴离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根，以及苯甲酸根、山梨酸酯、柠檬酸盐、和邻磺酰苯甲酰亚胺等。而IonPac AS14柱适用于分离一般的阴离子，不适合分离有机物(醋酸盐除外)。IonPac AS14柱使用等度淋洗，在分离时会快一些。抑制电导可以排除非离子组分的干扰，使方法灵敏度很高。无机阴离子可以检测到30~400 ng/L， 有机阴离子可以达到200~2000mg/L， 其线性范围超过两个数量级。氯离子和溴离子在药品中的回收率超过97%，这种方法适用于痕量阴离子的测定。 图5咳嗽药中的阴离子 图6咳嗽药中的阴离子 图7感冒药中的对离子 阴离子 图8感冒药中的阴离子 Dionex China LTD.----