油类样品中胆固醇检测方案(液相色谱仪)

表 1. DGLC-MS/MS 泵梯度洗脱及阀切换程序 精密度与重现性 采用双三元液相色谱仪在线固相萃取除杂，并同时进行色谱分离，串联三重四极杆质谱定性定量检测不同油类中胆固醇含量，与现有方法相比具有前处理方便、灵敏度高、重现性好等优点。 引言 胆固醇(结构式见图1)，又称胆甾醇。一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高，所以胆固醇本身并非是对人体有害的物质。但众所周知胆固醇摄入过多，就会引起高胆固醇血症，进而形成冠状动脉粥样硬化性心脏病等所谓的“富贵病”，因此需要控制的是胆固醇的摄入量。胆固醇主要来自人体自身的合成，油类等食物中胆固醇是次要补充，专家建议每天摄入50 mg~300 mg 胆固醇为佳。油类是百姓餐座上必不可少的用品，目前市场上各种品牌食用油的种类少说也有十几种，再加上商家各种炫目的噱头“零胆固醇”，经常把人晃得不知所措。其实一般而言动物油的饱和脂肪酸比例较高，大多含有胆固醇，相对而言植物油中胆固醇较低。同时对于屡禁不绝的“地沟油”检测也多采用胆固醇，多环芳烃，电导率，特定基因组成等4类有效指标，因食用植物油中一般不含胆固醇或含量极低，而地沟油中可能含有动物源性成分，如果检出胆固醇并超过一定范围，可怀疑该油脂为地沟油。 图1.胆固醇结构式 国内关于不同食品中胆固醇的测定方法主要有比色法、气相色谱法(GC)2、高效液相色谱法(HPLC)3等，并且随着质谱技术的普及，也出现较多的 LCMS 检测胆固醇的方法4.5，前处理方法主要是采用皂化，萃取，浓缩，复溶等繁琐过程，相反采用固相萃取小柱对植物油样品进行前处理净化，可以带来操作简单、方法快速，净化效果优异，回收率稳定等优点。因此本文的创新点在于，采用在线固相萃取的方法，将前处理过程与液相分离结合起来，保证油类等复杂基质中的胆固醇能够与杂质分离，并采用高灵敏度质谱定性定量检测样品中微量胆固醇。通过在线固相萃取，油类样品经过皂化后，稀释过滤后直接进样。由于胆固醇在205nm 紫外末端检测，干扰大，导致分析时间长，检测限有限，因此采用串联质谱可以很好的提高检测限及专属性，本方法的样品定量限9 pg/kg，较已报道方法具有明显优势4.5。采用QED 功能，在定量分析的同时，比较 标准品与样品胆固醇峰的子离子全扫描信息，避免出现假阳性结果。通过该方法可实现样品快速化前处理(不需要正己烷多次萃取)，快速系统分离效果好(包括SPE在内，10 min/样品)，且精密度和回收率良好，适于大批次样品的快速检定； SPE小柱可在分析过程中在线净化，重复使用，大大节省测试成本。 材料与方法 仪器 双三元液相色谱仪 (Thermo Scientific Dionex Ultimate DGP3600RS 系列，配置6通道真空脱气机 SRD3600， 双梯度快速分析型色谱泵 DGP3600 RS (两个完全一致，同时又相互独立的三元泵，通过 Chromeleon 软件一体化控制)，自动进样器 WPS3000TSL， 柱温箱 TCC-3000(配有六通阀)，变色龙色谱管理软件Chromeleon 6.8， 配置 DCMSLink 插件串联质谱； 质谱系统： TSQ Vantage 三重四极杆质谱系统，配有 Xcalibur数据处理系统(赛默飞世尔科技有限公司，美国)，离子源：APCL. 试剂和对照品 乙腈 (Optima 级， Fisher Chemical， P/N A955-4， LOT 138549)异丙醇 (HPLC 级， Fisher Chemical， P/N A451-4， LOT135261)甲醇 (HPLC级， Fisher Chemical， P/N A454-4，LOT135154)去离子水，18.2 MQ-cm (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC， P/N 50131948) 氢氧化钾，优级纯(上海安谱科学仪器有限公司)胆固醇标准品99.99%， 购自 Sigma-Aldrich。 标准品溶液制备 称取胆固醇标准品5mg， 置100ml棕色量瓶中，以甲醇溶解定容至刻度，作为胆固醇标准品母液；再精密量取耳液，以50%甲醇水溶液逐级为浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、10、50、100、800 ng/ml 的标准工作溶液。 样品溶液制备 实际样品：参考文献油脂皂化方法[6]将油类样品微微加热并摇动，使每个样品混合均匀。称取2g待测油脂样品，置于25ml容量瓶中，依次加入4 ml 0.5 mol/I KOH 溶液、10 ml Z醇溶液，在60℃水浴锅中缓慢皂化4h，期间不时振摇容量瓶使皂化完全。皂化完成后，取出容量瓶冷却至室温，过 0.45 um有机滤膜后，取滤液0.5ml， 加入0.5ml去离子水，混匀待测。加标样品：品取2g油类样品，加入0.1 ml 浓度为 15 mg/l的标准品溶液，与样品按照相同步骤同步前处理，即得。 ( 色谱条件 ) ( Online SPE 及色谱分离条件： ) ( SPE Column： Therm o Cyclone M A X 柱 (1.0×50 mm， P /N CH- 952979， S/N931606)， ) ( Analytical Colu m n： Thermo Accucore C18 色 谱柱(2.1×150mm 2.6 p m， P/N 17126-152130， S/N 10188003) ) ( Mobile Phase： ) ( Left Pump (Onlin e SPE Pump) ： Mobile Phase A ： H2 0 (含0.1%甲酸，2mM甲酸氨)，Mobile Phase B ：异丙醇(含0.1%甲酸)； ) Right Pump (Analytical Pump)： Mobile Phase A： ACN (含0.1% ( 甲酸)， Mobile Phase B： 异 丙 醇(含0.1%甲酸) ； ) 柱温：45℃，进样量：10pL，六通阀切换程序及梯度淋洗条件如 Tab1， Online SPE 流路如图2。 图2.Online SPE-DGLC-MS 仪器流路图 时间 (min) 流速(mL/min) SPE 泵梯度比例B% 时间 (min) 流速(mL/min) 分析泵梯度比例 B% 切换时间(min) 阀位置 0 2.0 5 0 0.5 5 0 1-2 3 2.0 5 4 0.5 30 3 6-1 3.2 2.0 20 6 0.5 90 5 1-2 4.5 2.0 50 8 0.5 90 8.0 2.0 95 8.1 0.5 5 9.0 2.0 95 10 0.5 5 9.1 2.0 5 0.5 10 2.0 5 0.5 质谱条件 离子源：放电电流：10uA，雾化温度：400℃，鞘气： 25arb，辅助气：15 arb，碰撞气：1.5m Torr， 离子传输管温度：280℃ HSRM：通过进行 H-SRM扫描，采用增强定量数据关联二级扫描 (QED-MS/MS)， 使 MS/MS 全扫描数据更加干净， 并减少杂质干扰，使得该数据在定量分析的同时，进行定性确证，避免假阳性的发生。质谱扫描参数：数描方式： QED-SRM， 扫描循环时间：0.5s，分辨率：Q1，Q3分辨率均设置为 0.7 FWHM。胆固醇质谱扫描条件见表2. 表 2. SRM 模式下的质谱条件 Name Scan Mode Parent Mass Product Mass CE S-lens Cholesterol Positive 369.196 81.088* 33 73 369.196 147.130** 23 73 *定性离子对，**定量离子对 结果与讨论 标准品及样品色谱图 图3.胆固醇标准品和样品质量色谱图 取浓度为 1.6，8.0，640 pg/L 的对照品溶液及样品2溶液重复进样7针，色谱峰面积RSD分别为4.05%，4.43%，2.90%，2.50%保留时间的RSD分别为0.12%，0.12%，0.07%，0.08%。 线性、检出限 取不同浓度胆固醇标准工作溶液依次进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归，权重1/X，结果胆固醇在 0.5~800 ng/ml 的范围内，线性结果良好，标准曲线为Y=41.8924+389.502*X， R^2=0.9910。以三倍信噪比计算得到目标化合物的检出限(LOD)为0.2 ng/ml。 图4.胆固醇线性图 RT： 0.00-10.00 SM：5B NL：1.23E2 m/z= 146.60-147.60 F： +c APCI SRM ms2 369.196 [81.038-81.138， 147.080-147.180] MS 图5.胆固醇定量限质量色谱图 回收率与基质效应 参考 Fan et al.所采用的方法[7]评价回收率(RE)与基质效应(ME)：以不含基质的50%甲醇水溶液标准品溶液峰面积为A，样品经提取后的溶液加入至相同浓度的标准品溶液峰面积为B，未加标的样品中原有的胆固醇峰面积为C， 则 ME(%)=(B-C)/A*100，结果为90.37%。回收率则是通过比较相同的样品提取前后加入相同浓度 的标准品溶液后，计算峰面积比值获得皂化方法提取回 收率，结果为86.10%。 样品分析 为考察不同油类中胆固醇的含量情况，本文选取了3种不同的油类进行测试，结果见表3。 表3.不同油类中胆固醇定量测定结果 油类 含量(pg/g) 调和油 0.094 菜籽油 0.137 抽油烟机中废油 1.442 通过 QED 全扫描样品与标准品的子离子结果，预先添加胆固醇标准品二级谱图到谱库，然后对样品子离子谱图进行质谱库的检索，其匹配度>90%，定性结果表明样品是胆固醇。另外不同浓度胆固醇的相对离子丰度比(81.088：147.130)为80%，偏差<20%，满足欧盟 2002/657/EC 指令的四个鉴定点和公差要求，369.196/147.130是合适的定量离子对。样品的离子丰度比也与标准品一致，更加表明该样品时是胆固醇。 结论 本方法的优势在于通过在线固相萃取技术，简化了样品前处理步骤，节省了样品前处理时间，也提高了方法的重现性，并且通过串联质谱提高了样品检出限，通过QED，对比定量定性离子丰度等手段增强了样品定性能力，避免了假阳性结果。 图7.样品与胆固醇标准品定量定性子离子丰度比 ( 参考文献 ) ( [ 1 ]GB/T 5 0 09.128-2003食品中胆固醇的测定 ) ( [2] DBS22/ 004-2012食品安全地方标准植物油中胆固醇的测定气相色谱-质谱法 ) ( [3] GB/T22220-2008 GB/T 22220-2008 食品中胆固醇的测定高 效液相色谱法 ) ( [4]安徽省地方标准 DB 34/T 1 76 5—2012动物油脂中胆固醇 含量的测定液相色谱串联质谱法 ) ( [5]余雯静，郑利，沈崇玉.地沟油中胆固醇的LC/MS/MS定性定量检测[J]重庆理工大学学报(自然科学)， 2011， 2 5(12)： 4 1-45. ) ( [6]郭涛，杜蕾蕾，万辉，何东平.高效液相色谱法测胆 固醇含量鉴别地沟油[]食品科学，2009，30(22)：286-289. ) ( [7] Fan S， Wang X ， L i P， Z hang Q， Z hang W . J SEP SCI， 2011 ， 34(6)，640-650. ) Thermo FisherSCIENTIFIC 免费服务热线：支持手机用户)AN_C_LC-      胆固醇（结构式见图1），又称胆甾醇。一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高，所以胆固醇本身并非是对人体有害的物质。但众所周知胆固醇摄入过多，就会引起高胆固醇血症，进而形成冠状动脉粥样硬化性心脏病等所谓的“富贵病”，因此需要控制的是胆固醇的摄入量。胆固醇主要来自人体自身的合成，油类等食物中胆固醇是次要补充，专家建议每天摄入50 mg~300 mg 胆固醇为佳。油类是百姓餐座上必不可少的用品，目前市场上各种品牌食用油的种类少说也有十几种，再加上商家各种炫目的噱头“零胆固醇”，经常把人晃得不知所措。其实一般而言动物油的饱和脂肪酸比例较高，大多含有胆固醇，相对而言植物油中胆固醇较低。同时对于屡禁不绝的“地沟油”检测也多采用胆固醇，多环芳烃，电导率，特定基因组成等4类有效指标，因食用植物油中一般不含胆固醇或含量极低，而地沟油中可能含有动物源性成分，如果检出胆固醇并超过一定范围，可怀疑该油脂为地沟油。