烟叶中氨基酸检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：4006 165163UPLC测定烟叶中的氨基酸含量 样品溶液的制备及衍生 将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用80%的乙醇水溶液10mL 在室温下超声波提取0.5h，过滤，滤渣加入10mL相同体积分数的乙醇再提取一次，滤液合并，倒入732型阳离子交换柱中，用95mL4M/L氨水淋洗，淋洗液于80℃下浓缩至干，再用3mL0.1M/L稀盐酸溶解，溶液离心分离20min，用0.45pm微孔滤膜过滤，滤液中取10pL按衍生标准法操作。进样量1ul。 对照品储备液的制备 1mM/L色氨酸标准液：称取色氨酸20.4 mg，加超纯水溶解至100ml。含色氨酸的标定标准：取1支沃特世氨基酸水解液标品，打开后吸取1 mL，放在一支干净的1.5x15cm试管中，加2.5 mL色氨酸标准液、6.5mL超纯水，旋涡混匀，每支Eppendorf 管分装1mL备用。浓度见表2。 名称 名称 分子量 C(mM/L) C(mg/mL) 1 天门冬氨酸 133.10 0.25 0.03328 2 丝氨酸 105.09 0.25 0.2627 3 谷氨酸 147.13 0.25 0.03678 4 甘氨酸 75.067 0.25 0.01877 5 组氨酸 155.15 0.25 0.03879 6 精氨酸 174.20 0.25 0.04355 7 苏氨酸 119.12 0.25 0.02978 8 丙氨酸 89.093 0.25 0.02227 9 脯氨酸 115.13 0.25 0.02878 10 胱氨酸 240.30 0.125 0.03004 11 酪氨酸 181.19 0.25 0.04530 12 缬氨酸 117.15 0.25 0.02929 13 蛋氨酸 149.21 0.25 0.03730 14 赖氨酸 146.19 0.25 0.03655 15 异亮氨酸 131.17 0.25 0.03279 16 亮氨酸 131.17 0.25 0.03279 17 苯丙氨酸 165.19 0.25 0.04130 18 色氨酸 204.23 0.25 0.0510 表1.氨基酸使用液浓度。 衍生试剂制备 将烘箱预热至55±1℃，取一瓶衍生剂粉2A，轻轻敲动以确保打开前所有粉在瓶底；移取1mL稀释液2B至2A瓶中，盖紧瓶盖，旋涡混匀10s，S，55℃加热5-10min使衍生剂粉溶解(加热不得超过10 min)。将溶解后的衍生试剂放入干燥器中，可在室温保存1星期。 衍生标准品 将烘箱预热至55±1℃；用微量进样器吸取10uL标定标准至一支干 净的样品管底部；移取70pL硼酸缓冲液至样品管中，短暂旋涡混匀；移取20pL衍生剂剂至样品管中，立即旋涡混匀数秒钟；室温放置1 min；用封口膜封口，55℃加热5 min。 色谱条件 色谱柱： 沃特世ACQUITY UPLC BEHCg 2.1x100 mm， 1.7um紫外检测波长： 248 nm柱温： 55℃ 梯度洗脱条件见表1。理论塔板数以谷氨酸计算不低于5000。 时间(min) 流速 淋洗液 淋洗液 梯度 (mL/min) A(%)(VV) B(%)(V/V) 洗脱曲线 0 0.7 99.9 0.1 6 0.54 0.7 99.9 0.1 7 5.74 0.7 90.9 9.1 6 7.74 0.7 78.8 21.2 6 8.04 0.7 40.0 60.0 6 8.64 0.7 40.0 60.0 6 8.73 0.7 99.9 0.1 6 9.5 0.7 99.9 0.1 6 表2.梯度洗脱。 淋洗液A：取AccQTagM Ultra Eluent A 50 mL加入超纯水950mL。 淋洗液B：取AccQ·Tag Ultra Eluent B 结果 图1.氨基酸对照品(A)和烟叶(B)UPLC色谱图。 组 丝 精 甘 天冬 谷 苏 丙 脯 胱 赖 酪 甲硫 缬 异亮 亮 苯丙 色 总量 烤烟 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 氨酸 1 0.085 0.128 0.485 0.014 0.128 0.273 0.089 0.101 1.128 0.011 0.418 0.052 0.061 0.112 0.05 0.158 0.241 0.157 3.691 2 0.097 0.157 0.569 0.012 0.206 0.314 0.092 0.102 1.562 0.011 0.334 0.048 0.062 0.102 0.06 0.175 0.334 0.138 4.375 3 0.09 0.134 0.678 0.021 0.135 0.238 0.087 0.118 1.084 0.012 0.329 0.026 0.012 0.141 0.067 0.171 0.128 0.108 3.579 4 0.088 0.152 0.632 0.028 0.178 0.501 0.096 0.109 1.068 0.015 0.336 0.038 0.083 0.139 0.082 0.214 0.139 0.09 3.988 5 0.099 0.157 0.558 0.025 0.210 0.331 0.100 0.117 1.021 0.013 0.365 0.091 0.052 0.128 0.07 0.168 0.15 0.119 3.774 6 0.078 0.181 0.648 0.027 0201 0.426 0.097 0.112 1.129 0.012 0.320 0.089 0.053 0.135 0.069 0.164 0.241 0.165 4.147 7 0.096 0.154 0.748 0.029 0.188 0.551 0.101 0.098 1.111 0.011 0.401 0.425 0.061 0.143 0.081 0.202 0.234 0.091 4.724 8 0.085 0.167 0.806 0.021 0.176 0.290 0.108 0.111 0.994 0.010 0.476 0.095 0.052 0.131 0.07 0.164 0.351 0.131 4.238 9 0.079 0.182 0.624 0.026 0.199 0.384 0.109 0.105 0.984 0.009 0.485 0.105 0.055 0.135 0.073 0.18 0.173 0.166 4.073 10 0.105 0.207 0.593 0.029 0.175 0.347 0.112 0.121 1.327 0.013 0.423 0.092 0.055 0.154 0.074 0.174 0.201 0.155 4.357 11 0.084 0.169 0.674 0.027 0.134 0.317 0.189 0.134 1.546 0.097 0.442 0.088 0.041 0.151 0.089 0.251 0.218 描述 部件号 ACQUITY UPLC BEHCg 1.7um， 2.1x100mm 186002352 VanGuard Pre-column， ACQUITY UPLC BEH C。 186003022 2.1x5 mm， 1.7 um， 3 pcs/pack 186003975 AccQTag Ultra衍生试剂，可进行250次分析 186003836 AccQ.Tag Ultra洗脱液A(浓缩液)， 950mL 186003838 AccQTag Ultra洗脱液B， 950mL 186003839 水解氨基酸标样，10x1mL安部管 WAT088122 全回收样品瓶，100个样品瓶/包 186000384C 或可单独订购AccQ·Tag Ultra ACQUITY UPLC氨基酸分 析方法包(包括AccQ·Tag Ultra试剂包、色谱柱、洗 176001235 脱液A和B、衍生管、氨基酸标准品、全回收样 品瓶) 或UPLC AAA 应用功能拓展套件(配合标准ACQUITY UPLC系统用于氨基酸分析、包括包括AccQ.Tag Ultra 色谱条件色谱柱: 沃特世ACQUITY UPLC® BEH C18, 2.1 x 100 mm, 1.7μm紫外检测波长: 248 nm柱温: 55 ˚C