复方氨基酸注射液中含量检测方案(制备液相色谱)

Agela Technologies博纳艾杰尔产品应用案例 地址：天津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462电话：022-25321032 传真：022-25321033 复方氨基酸注射液中氨基酸分析报告 AP10037 应用及技术服务部 摘要：本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂，并在衍生过程中加入二巯基二丙酸(MPA)保护半胱氨酸。同时采用反向高效液相色谱法，以正亮氨酸为内标物，使用Venusil@AA氨基酸分析方法包，分析复方氨基酸注射液样品中氨基酸组成。本方法快速、灵敏、准确，特别适用于同时含有胱氨酸和半胱氨酸的多肽氨基酸组成的测定。 关键词：高效液相色谱法；异硫氰酸苯酯(PITC)；复方氨基酸注射液；；VenusilAA；胱氨酸；半胱氨酸 前言 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 本实验采用Venusil@AA氨基酸分析方法包中的检测标准，使用Venusil@AA氨基酸分析专用柱对复方氨基酸注射液中的氨基酸组成进行了测试。 实验部分 仪器、试剂与材料 试剂材料 流动相A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850 mL 溶解，用冰醋酸调节 pH至6.5，然后加入乙腈140mL， 混匀； 流动相B：乙腈：水=80：20； 稀盐酸：0.1 mol/L 盐酸； 二疏基二丙酸(MPA)溶液：取MPA约8.0 mg， 加入200 mol/LNaOH溶液 1mL溶 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 解； 内标溶液：称取正亮氨酸 10 mg， 置于 10 mL容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度； 色氨酸：称取色氨酸 10 mg， 置于10mL容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度； 三乙胺乙腈溶液：取Venusil@AA 氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶，加乙腈 8.6 mL，混匀； 异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取 Venusil@AA 氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液1瓶，加乙乙2.0mL，混匀； 氨基酸标准溶液：取 Venusi1@AA氨基酸分析方法包中17种氨基酸标准溶液(包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸)1.0mL， 加色氨酸溶液 0.5 mL， 稀盐酸3.5 mL稀释，混匀； 复方氨基酸注射液样品：无色透明液体，，由某医药科技公司提供。 样品制备 移取复方氨基酸注射液样品1.0mL， 置于50 mL 离心管中，加入稀盐酸30 mL，混匀，作为样品溶液，待衍生使用。 氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生 取18种氨基酸标准溶液(含色氨酸2.5 umol/mL)、上述复方氨基酸样品溶液各200uL，分别置于1.5 mL离心管中，向每个离心管中加入 MPA 溶液 40 pL， 再向每个离心管中加入内标溶液20 uL， 混匀，然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100uL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 pL，混匀，室温放置1小时。再向每个离心管中加入400 uL 正己烷，振摇后放置 10 min， 取下层溶液 200uL， 加 800 uL水稀释，经0.45 um针筒过滤器过滤，I取续滤液作为样品试液。 色谱条件 色谱柱：Venusil@AA； 5 um； 4.6×250mm； 流速1.0 mL/min：柱 温 ：440℃： 波 长：：：254nm： ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 进样量： 10uL； 梯度： 表1.液相色谱梯度洗脱条件 时间/min A/% B/% 0 100 0 2 100 0 15 90 10 25 70 30 33 55 45 33.1 0 100 38 0 100 38.1 100 0 45 100 0 结果与讨论 本实验采用Venusil@AA氨基酸分析方法包对复方氨基酸注射液中氨基酸进行了测试，由表2及图2可知，使用 Venusil@AA 氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好。 表2.复方氨基酸注射液中氨基酸测试结果 色谱峰序号 对照溶液 样品溶液 保留时间/min 氨基酸名称 保留时间/min 氨基酸名称 1 4.494 门冬氨酸 4.457 门冬氨酸 2 5.244 谷氨酸 3 10.766 丝氨酸 10.716 丝氨酸 4 11.628 甘氨酸 11.531 甘氨酸 5 12.096 组氨酸 12.043 组氨酸 6 13.339 胱氨酸 13.277 胱氨酸 7 13.743 精氨酸 13.702 精氨酸 8 14.940 苏氨酸 14.883 苏氨酸 9 15.662 丙氨酸 15.599 丙氨酸 10 16.396 脯氨酸 16.356 脯氨酸 11 22.940 酪氨酸 22.956 酪氨酸 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w. ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 博纳艾杰尔产品应用案例 12 24.304 缬氨酸 24.310 缬氨酸 13 25.277 蛋氨酸 25.282 蛋氨酸 14 27.334 异亮氨酸 27.334 异亮氨酸 15 27.642 亮氨酸 27.635 亮氨酸 16 28.258 正亮氨酸 28.262 正亮氨酸 17 29.154 苯丙氨酸 29.162 苯丙氨酸 18 29.610 色氨酸 29.647 色氨酸 19 30.850 赖氨酸 30.861 赖氨酸 图1.19种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图 WD1 A Vavel engt h=254 nm (吕春悦\氨基酸注射液样品000002.D) 图2.复方氨基酸注射液供试品溶液高效液相色谱图 结论 根据实验结果，使用Venusil@AA 氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好，能够满足检测要求。 附：相关产品 产品名称 规格描述 包装数量 订货号 Venusil@AA 氨基酸分 1 AA952505-K ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w. ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 析方法包 Venusil@AA氨基酸分析专用柱 4.6×250mm， 5 um 1 AA952505-0 异硫氰酸苯酯(PITC) 25 uL 10 AA-D 氨基酸标准溶液(含17种氨基酸) 1mL 2 AA-S 正亮氨酸(Nle) 100 mg 1 AA-I 三乙胺(TEA) 1.4 mL 2 AA-B 色氨酸(Trp)，单独订购 100 mg 1 AA-T 1.5 mL 样品瓶 短螺纹透明带书写处32×11.6mm 100/PK 1109-0519 1.5 mL样品瓶盖 9mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色 PTFE 隔垫45°Shore A； 1.0 mm 100/PK 0915-1819 微孔滤膜 单膜，13mm， 0.45 um 100个/包 AS021345-T ·次性注射器 2mL无针头 100支/包 LZSQ-2ML ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w.ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 )