人体血液中糖化血红蛋白检测方案(液质联用仪)

田岛津SHIMADZUExcellence in ScienceSSL-CA14-428 Excellence in ScienceLCMSMS-274 上海市淮海西路570号红坊E楼 应用超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪选择离子监测模式快速测定人体血液中糖化血红蛋白含量 LCMSMS-274 摘要：糖化血红蛋白(HbA1c)是测定长期血糖水平的金标准，作为糖尿病并发症风险预测因子在临床上广泛应用。国际临床化学协会(IFCC)的 HPLC-MS 方法是采用质谱的选择离子监测模式(SIM)进行测定，本文在 IFCC参考方法的基础上建立了基于岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪选择离子监测(SIM)快速准确测定人体血液中糖化血红蛋白含量的方法。校准曲线线性良好，线性相关数>0.9999，回收率99.6~100.3%；对两个浓度的质控样品进行了检测精密度、重复性及准确度的考察，保留时间、峰面积、测定浓度的相对标准偏差范围分别为 0.196~0.323%、1.781~1.832%、0.864~1.300%，高低质控样品测定值与靶值的相对误差分别为 0.645%、0.220%，测定结果满足国际临床检验协会(IFCC) 相关要求。 关键词：糖尿病糖化血红蛋白超高效液相色谱三重四极杆质谱选择离子监测 糖化血红蛋白(HbA1c)不仅是 WHO 及一些国家专业学术团体推荐的糖尿病诊断标准，也是糖尿病血糖控制目标，以及评价糖尿病治疗方案有效性的指标。与血糖监测相比， HbAlc 检测有一定的优势， HbAlc 没有短期波动，其结果相对稳定且在一天的任意时间段都可以检测。国际上主要的标准化检测方法是美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)制定的 HPLC 法及国际临床化学协会(IFCC)制定的 HPLC-MS 法。 国际临床化学协会(IFCC)的方法被公认为糖化血红蛋白检测的标准参考方法。它的原理是通过葡萄糖-C蛋白内切蛋白酶将血红蛋白裂解为β链上糖化和未糖化的N-端六肽。这些六肽从肽混合物中分离出来，再通过HPLC-ESI/MS 法或 CE-UV 法定量测定。本文用岛津 LCMS-8050 对糖化血红蛋白水解六肽进行测定，该方法能够简单、快速、准确的测定糖化血红蛋白的含量。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统，包括LC-30ADx2(输液泵)， SIL-30AC (自动进样器)， CTO-30AC (柱温箱)， CBM-20A(系统控制器)， DGU-20As(在线脱气机)， LCMS-8050(三重四极杆液质)和 LabSolutions Ver 5.86。 1.2分析条件 液相色谱条件 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液， B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流 速： 0.5mL/min 色谱柱： Shim-pack GISS 2.1 mm I.D. x50 mm L.， 1.9 um 柱 温： 50℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，初始浓度为B相10%，时间程序见表 2 表2 梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps B.Conc 10 2.50 Pumps B.Conc 25 2.51 Pumps B.Conc 98 4.00 Pumps B.Conc 98 4.01 Pumps B.Conc 10 5.00 Controller Stop 进样量：0.5uL 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 离子源： ESI(+) 离子源接口电压： 4.5 kV 加热气： 空气 10 L/min 雾化气：氮气 3.0L/min干燥气：氮气10 L/min碰撞气：氩气 源温： 350℃ 脱溶剂管温度： 250℃ 加热模块温度： 500℃ 扫描模式： 选择离子监监(SIM) 驻留时间及延迟时间： 100 ms、3 ms Excellence in Science 表3 SIM参数 物质名称 英文名 SIM离子 糖化血红蛋白(HbA1c) Glycated hemoglobin 429.2 非糖化血红蛋白(HbA0 IS) Non-glycated hemoglobin 348.2 1.3标准溶液的配制及样品前处理 标准溶液配制：将HbAlc 浓度为0、3.029%、6.191%、9.601%、13.199%、17.192%的校准液、质控品、样品，用纯水稀释100倍待测 样品前处理步骤：均按照 IFCC推荐前处理方法进行样本制备；新鲜的血液采用 EDTA抗凝，取1.5 mL血8℃ 3000xg离心10 min， 弃去血浆， 10 mL盐水洗涤沉淀2次。10 mL盐水溶液混溶，37℃孵育细胞4h。弃去上清，1.0 mL水混匀细胞。计算总的血红蛋白浓度，与等量的50mMβ-吗啉代乙磺酸混合，将总血红蛋白稀释至50 mg/mL。加 NaOH(4 mol/L)调整 pH至6.2。3000×g 离心 20 min 去除细胞碎片。加入 50 uL 内切蛋白酶 Glu-C，约1mg总血红蛋白溶解在 500 pL 消化液中。轻轻盖上瓶盖，37℃孵育，轻微摇动18h， 形成糖基化的和未糖基化的β链N末端六肽。-20℃冷冻2h 终止蛋白水解。解冻样本，8000xg离心2 min， 取上清进样分析。 结果讨论 2.1标准品色谱图 图1 HbAlc 校准点2(3.029%)色谱图 2.2线性关系 将 HbAlc 浓度为0、3.029%、6.191%、9.601%、13.199%、17.192%的校准液，用纯水稀释100倍，按前述分析条件测定，以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标， HbA0 为内标，制作校准曲线，相关数据及标准曲线如图2所示。线性方程、线性范围和相关系数见表4。 Excellencein Science Area Ratio 图2HbAlc 校准曲线 表4 HbAlc 线性方程及相关系数 物质名称 校准曲线 线性范围 准确度(%) 相关系数R (%) HbAlc Y=0.0051X+(-7.6×10) 0-17.192 99.6~100.3 0.9999 2.3重复性实验 将QC1， QC2，用纯水稀释100各，各平行测定6次，计算保留时间、峰面积及质控浓度的相对标准偏差，考察仪器和方法的重复性。相关原始数据如图3所示，保留时间、峰面积及质控浓度的相对标准偏差如表5所示，测量值与靶值的相对误差如表6所示 图3 HbA1c 质控品QC2重复性数据及色谱图 表5 HbA1c 保留时间、峰面积、浓度的重复性结果(n=6) 物质名称 RSD %(QC1) RSD%(QC 2) R.T. Area Conc. R.T. Area Conc. Excellence in Science HbAlc 表6HbAlc 浓度检测结果与靶值的相对误差%(n=6) 物质名称 QC 1 相对误 测量均 QC2 测量均值 靶值 靶值 相对误差% 差% 值 HbA1c 5.286 5.252 0.645 3.281 3.274 0.220 2.6实际样品测定结果 将提供的实际样品，用纯水稀释100倍，直接进样测定，结果如表7所示。 表721份样品中 HbAlc 定值结果 客户编号 NGSP HbA1c 含量(%) IFCC HbA1c 含量(mmol/mol) Sample 1 3.469 14.397 Sample 2 4.523 25.918 Sample3 7.454 57.958 Sample 4 10.648 92.873 Sample 5 6.775 50.536 Sample 6 5.292 34.324 Sample 7 7.991 63.828 Sample 8 10.964 96.327 Sample 9 3.401 13.653 Sample 10 4.468 25.317 Sample 11 5.304 34.456 Sample 12 6.813 50.951 Sample 13 9.668 82.160 Sample 14 4.237 22.792 Sample 15 3.687 16.780 Sample 16 5.377 35.254 Sample 17 7.042 53.454 Sample 18 7.829 62.057 Sample 19 5.461 36.172 Sample 20 8.071 64.703 Sample 21 4.002 20.223 注： NGSP 美国糖化血红蛋白标准化计划 IFCC 国际临床化学协会 单位换算公式： YNGsp=0.09148XIFcc+2.152 结论 本文建立了基于岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪选择离子监测模式快速测定人体血液中糖化血红蛋白含量的方法。结果显示：校准曲线线性良好，线性相关系数>0.9999，对两个浓度的质控样品进行了检测精密度、重复性及准确度的考察，保留时间、峰面积、测定浓度的相对标准偏差范围分别为 0.196~0.323%、1.781~1.832%、0.864~1.300%：高低质控样品测定值与靶值的相对误差分别为 0.645%、0.220%，测定结果满足国际临床检 Excellence in Science 岛津全球应用技术开发支持中心 验协会(IFCC)相关要求。21份样品中的 HbA1c 测定结果见表7。综上所述，该方法能够 LCMSMS-274简单、快速、准确的测定糖化血红蛋白的含量，可作为该物质的标准测定方法推广应用。 糖化血红蛋白（HbA1c）是测定长期血糖水平的金标准，作为糖尿病并发症风险预测因子在临床上广泛应用。国际临床化学协会(IFCC)的HPLC-MS方法是采用质谱的选择离子监测模式（SIM）进行测定，本文在IFCC参考方法的基础上建立了基于岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪选择离子监测（SIM）快速准确测定人体血液中糖化血红蛋白含量的方法。校准曲线线性良好，线性相关数>0.9999，回收率99.6~100.3%；对两个浓度的质控样品进行了检测精密度、重复性及准确度的考察，保留时间、峰面积、测定浓度的相对标准偏差范围分别为0.196~0.323%、1.781~1.832%、0.864~1.300%，高低质控样品测定值与靶值的相对误差分别为0.645%、0.220%，测定结果满足国际临床检验协会（IFCC）相关要求。