骨头中DNA检测方案(研磨机)

Vol.34. No.1January， 2014第 四 纪 研 究QUATERNARY SCIENCES第34卷 第1期2014年1月 188第 四 纪 研 究2014年 doi：10.3969/j.issn.1001-7410.2014.01.22 文章编号 1001-7410(2014)01-187-09 新疆石人子沟遗址出土家马的DNA研究* 赵 欣Q Antonia T Rodrigues尤悦 王建新马 健 任 萌 袁 靖 杨东亚.①② (①中国社会科学院考古研究所，北京 100710；②加拿大西蒙菲莎大学考古学系古 DNA 实验室，温哥华，V5A 1S6；③首都师范大学历史学院，北京 100048；④西北大学文化遗产学院，西安 710069) 摘要 运用古 DNA 技术对新疆石人子沟遗址的墓葬中出土的古代家马样本进行遗传学分析。共选取5匹家马骨骼样本，从中提取 DNA 并对线粒体 DNA 控制区和毛色控制基因的核 DNA 进行 PCR 扩增。全部样本获得了线粒体DNA序列，在这5个序列中共检测出3个不同的单倍型，可以归属到3个不同的谱系A，B和E。毛色控制基因的 SNP 检测结果显示石人子沟遗址古代家马有栗色(chestnut)、枣色(bay)和金黄色(palomino)3种不同毛色。尽管样本量很小，但是线粒体 DNA 和毛色控制基因的核 DNA 研究均显示出人人子沟遗址的古代家马具有较高的遗传多样性。结合古代文献记载和新疆的特殊地理位置，支持新疆是家马引人中国的一个重要通道的观点。此外，金黄色马与墓主人同葬于墓室，可能是当时特殊的选择，表明马在古代人类社会中具有着重要的地位。 主题词 石人子沟遗址 家马 古 DNA 毛色 中图分类号 K878，Q915.876，Q7 文献标识码 A 古 DNA 研究是利用现代分子生物学的手段提取和分析保存在古代人类和动植物遗骸中的古DNA分子以解决考古学问题。对考古遗址出土的动物遗骸进行古 DNA 研究是世界动物考古学研究的前沿领域，可以在现代动物群体遗传结构与谱系构成分析的基础上，推断古代动物群体历史遗传结构与谱系构成的变化规律，判断古代动物群体在特定时空范围内的系统地理分布模式，及与某些品种的关系，进而揭示其起源与驯化的历史等。 家马(Equus caballus)的起源、扩散及驯化研究是国际动物考古学界关注的热点课题。对考古遗址发现的家马骨骼进行古 DNA 研究，可以将DNA的精确度与考古遗存在时间上的古老性科学地结合起来2.3，对于进一步探讨家马起源和驯化历史具有重要意义。关于中国古代家马的DNA 研究，最早开始的是 Cai 等14.51采集了中国内蒙古、河南、山东、宁夏等省或自治区的9个考古遗址(年代跨度从夏家店下层文化时期到战国晚期，约4000~2200aB.P.出期)出土的46例马骨或牙齿样本进行 DNA 分析。研究认为中国古代家马的母系遗传具有很高的多样性，中国家马的起源比较复杂，既有本地驯化的因素，也有外来家马线粒体 DNA 基因的影响，但是是们与普氏野马(Equus ferusssp.przewalskii)没有直接的母系联系。在国外家马DNA研究中也包括有少量中国古代家马的样本，如Cieslak 等在进行家马线粒体 DNA 谱系的起源研究时对青海省互助县丰台遗址的3例家马个体进行了线粒体 DNA 分析； Ludwig 等在研究家马早期驯化阶段的毛色多样性时也包括了丰台遗址的家马。只是在这两项研究中，丰台遗址的家马并不是他们的主要研究对象。 新疆位于欧亚草原东端，自古以来就是中西文化交流的交通要道。因此，本文对新疆巴里坤县石人子沟遗址墓葬中出土的马骨进行了采集、DNA提取，并选择线粒体 DNA 控制区(mtDNAD-loop)和毛色控制基因的核 DNA 进行 PCR 扩增，以期研究新疆地区出土马骨的群体遗传学特征，并通过与国内外的古代和现代家马的比较，分析新疆地区在中国 ( 第一作者简介：赵 欣 女 31 岁 助理研究员 考古学专业古 DNA 研究 E-mail： zhaox@cass.org.cn ) ( *2011年度国家社科基金重大项目(批准号：11&ZD183)、国家文物局文物保护和科学技术研究项目(批准号：20110222)第51批中国博士后科学基金面上资助二等资助(批准号：2012M510694)和 Henry Luce Foundation，SFU SMALL SSHRC 共同资助 ) ( 2013-09-07收稿，2013-10-29收修改稿 ) 古代家马发展过程中所起的作用，以弥补新疆地区古代家马遗传学研究的空白。 1材料与方法 1.1 样本采集与处理 石人子沟遗址(原名东黑沟遗址)，位于新疆巴里坤县石人子村南、东天山(巴里坤山)北麓，地理坐标在43°31'12.8"~43°34"28.9"N，93° 13’44.8"~93°16'49.1"E之间。遗址南北长约5km，西西宽约3.5km，面积约 8.75km²。2006~2007年，新疆文物考古研究所、西北大学文化遗产与考古学研究中心联合对石人子沟遗址进行发掘，清理石筑高台1座、石围居址4座、中小型墓葬12座；墓葬均为中心凹陷的圆形石封堆，墓扩为长方形或椭圆形竖穴，位于封堆下的中部；多有人牲和殉殉；出土有陶、石、骨、铜质遗物和金银饰品等；墓葬年代约为西汉前期(西汉的年代为公元前206年至公元25年)。研究者认为这是一处规模较大、内涵较丰富、具有代表性的古代游牧文化聚落遗址。墓葬中出土有大量动物骨骼，其中马是以随葬动物的身份出现的。北京大学℃实验室对墓葬出土的家马骨骼等样本进行了C年代测定(表1)，经树轮校正后其年代范围为400~120BC。 在动物考古学家进行种属、性别、年龄鉴定的基础上，本文对出土于石人子沟遗址的墓葬中的5匹家马骨骼样本进行了采集，所采集的样本均为左侧股骨，以确保每一骨骼样本代表一个个体。样本的 具体信息见表1。 取1cm*1cm 见方的小块，用钻头打磨骨骼表面，特别是截面要仔细打磨，重复3次，以去除骨骼表面尘垢。次氯酸钠溶液(有效氯6%)浸泡10分钟，紫外照射2小时，每小时翻面。待晾干后放入液氮冷冻研磨机 FREEZER/MILL 6750(SPEX，美国)打磨成粉，-20℃保存备用。 1.2DNA 提取 DNA提取的方法是基于商业化试剂盒QIAquick@ PCR Purification Kit 试剂盒的硅柱法，最早由 Yang等使用。取1~2g骨粉放放15ml离心管中，加入3ml的裂解液(0.5M EDTA，0.5% SDS，0.4mg/ml蛋白酶K)，52℃孵育过夜以裂解胶原蛋白和溶解骨骼中的矿物质，使用 Amicon Ultra -4离心超滤管将裂解液浓缩至100uL，随后按照QIAquick@ PCR Purification Kit 试剂盒说明书操作进行DNA的提取，最后洗脱得到约100uL DNA 提取液，置于-20℃贮存。 1.3PCR 扩增及测序 由于古 DNA的含量低、高度降解和广泛损伤，几乎不可能一次性扩增较长的片段。为了得到较长的连续 DNA 序列，本文选择了 Cai 等“设计的两对套叠引物来扩增古代家马的线粒体DNA控制区的DNA片段(15473~15772，包括引物长度)，引物序列见表2。 表1石人子沟遗址的墓葬中出土古代家马样本采集情况 Table 1Horse skeletal samples excavated from Shirenzigou site 序号 样品编号 出土单位 骨骼名称 备注 C年代/aB.P. 树轮校正后年代(g=68.2%)/BC 1 EQ16 M12K3 左侧股骨 骨干中间 2265±30 400~230 2 EQ20 M12墓室 左侧股骨 远端 2230±25 380~210 3 EQ21 M12K2 左侧股骨 雌性个体 2150±25 350~120 4 EQ24 M11 左侧股骨 骨干中间 2230±25 380~210 5 EQ42 M1 左侧股骨 远端 2205±30 360~200 表2线粒体DNA 控制区 PCR扩增引物 Table 2Primers used for mtDNA D-loop amplification 引物名称* 引物序列(5'-3') 引物长度 PCR产物长度 退火温度(Tm)/℃ L15473 CTTCCCCTAAACGACAACAA 20 bp 220bp 52 H15692 TTTGACTTGGATGGGGTATG 20 bp L15571 AATGGCCTATGTACGTCGTG 20 bp 202bp 55 H15772 GGGAGGGTTGCTGATTTC 18 bp 此外，本文选择了6个毛色控制基因的8个5NP位点进行检测，以判断石人子沟遗址古代家马的毛色及其样式。表3列举了常见家马毛色及其样式的中英文对照，为便于表述1，文中涉及家马的毛色及其样式时采用简单的颜色来表示。本文选择了 Zhao 等121设计的引物对毛色控制基因的核 DNA片段进行 PCR 扩增。具体的基因、参考序列及变异位点详见表4。 线粒体 DNA 控制区和毛色控制基因的核DNA 的PCR反应体系一样，均为 30p.L，包括 4~5p.L 的DNA提取液，1~3U AmpliTaq Gold ( AppliedBiosystems)，50mM KCl，2. 5mM MgCl2，0.2mM dNTPMix，1. 0mg/ml BSA 和0. 3p.M引物。PCR 扩增程序如下：95℃12分钟，随后是94℃变性30秒、52~55℃退火30秒、72℃延伸40秒共60个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR 阳性产物送到测序公司(Invitrogen)直接测序，正反引物双向测序。 表3常见家马毛色及其样式的中英文对照 Table 3Common horse coat colors in both Chinese and English 英文 中文 中文描述II bay 枣色 身上毛发淡化为枣色(红褐色)，四肢、鬃毛和尾毛皆为黑色 chestnut 栗色 身上毛发、四肢、鬃毛和尾毛皆为栗色(红棕色)，鬃毛、尾毛或略浅 black 黑色 身体毛发、四肢、鬃毛和尾毛皆为黑色 buckskin 鹿皮棕色 主要由原毛色枣色演化而成，身上毛发为鹿皮棕色(黄褐色)，而四肢、鬃毛和尾毛为黑色 cream 乳白色 主要由原毛色枣色、栗色演化而成。马匹身上毛发为乳白色，而皮肤是粉红色及浅色的眼睛。如底色为栗 色，则鬃毛和尾毛呈现白色，此毛色视为象牙白色(cremellos)；如底色为枣色，则鬃毛和尾毛呈现浅红色，此 毛色视为浅红色(perlinos) dun 暗褐色 主要由原毛色枣色、黑色或栗色演化而成，身上毛发为暗褐色(土黄色到红褐色)，脸部、下腹、四肢、鬃毛和尾 毛为较深色或黑色 palomino 金黄色 主要由原毛色栗色演化而成，身上毛发为金黄色，四肢、鬃毛和尾毛为白色 silver 银色 主要由原毛色黑色稀释而成，淡黄色的鬃毛和尾毛，棕色或咖啡色的身体 tobiano pattern 白斑 白斑马的一种，杂色马中常见的斑点样式，在原毛色基础上有白色的毛色、粉色的皮色样的斑点 sabino spotted 白斑 白斑马的一种，腹部有白色斑点，脸部为白色、有时甚至延伸到眼部或下巴，四肢从蹄到膝部为白色 overo pattern 白斑 白斑马的一种，但不同于 tobiano。包括3种样式：1)Frame，即水平方向的白斑，多分布于头部、面部、颈侧部及 身体上；2)splashed white，散点状白斑，面部白色标记显著；3) sabino 表4毛色多态性的控制基因的相关信息(据文献) Table 4Genes associated with coat color variation typed in this study ( after reference) 基因 参考序列 GenBank No. SNP 变异位点 毛色 参考文献 MCIR X98012 g.201C>T C：non-chestnut(E) T：chestnet(e) |13| ASIP AF288358 g.2183~2193del -：non-black(A) Deletion 11 bp：black(a) [14] MATP (SLC45A2) AY187093 g.72G>A G：non-cream(C) [151 A：cream(cr) KIT AY048669 g.786G>C G：tobiano pattern(KM1) C：non-tobiano pattern(KM0) [16] KIT AY874542 g.1120T>A T：non-sabino spotted(sb1) A： sabino spotted(SB1) [17] SILV DQ665301 g.1457C>T C：non-silver(z) T：silver(Z) [18] SILV DQ665301 g.697A>T A：non-silver，linked with g. 1457C T：silver，coupled with g. 1457T [18] EDNRB AF038900 g.323_333TC>AG TC：non-overo pattern(ov) AG：overo pattern(OV) [19] 1.4 数据分析 PCR 产物所得到的序列使用 Chromas Pro 软件进行读取，通过 Clustal X2软件进行序列比对，并使用 BioEdit 进行编辑，这是进行 DNA 分析的前提和必要条件1201. 1.5 污染的防止 PCR技术是一把双刃剑，它的问世一方面为古DNA研究带来了可能，另一方面也正是因为 PCR技术的高度敏感性和古 DNA 含量极低，使得古DNA 研究极易受到污染。 实验验严格按照 Cooper 和 Poinar21]以及Poinar221等学者提出的古 DNA 操作规范进行。古DNA 研究在一个专门的古 DNA 实验室中进行，实验区域完全独立于其他现代分子生物学实验区域，从未进行过现代生物的 DNA 提取实验，并有正压的空气过滤系统，紫外(254nm)照射。在实验空间的设计上，将实验室分隔成几个区域：样本前处理区→DNA提取区→PCR制备区→PCR区，实验人员按箭头的方向移动，禁止做逆向活动。各区域的试剂和仪器严禁相互混用。各区域内的实验台、桌椅经常用次氯酸钠溶液擦拭，使用前和使用后用紫外照射，以去除残留的 DNA 分子，并用次氯酸钠溶液擦拭仪器表面。每次 DNA 提取与 PCR 扩增都要设置提取空白与PCR空白，用来判断是否存在外源污染。实验中所有样本都至少提取3次以上，并保证每次提取产物的结果相同。此外经国家文物局批准后本文的5个样本全部送至加拿大西蒙菲莎大学(SimonFraser University)考古学系古 DNA 实验室进行重复实验。所有实验结果完全一致才被确定是可靠序列。 2 实验结果 2.1 线粒体DNA控制区序列变异情况及单倍型类群归属 全部5个古代家马骨骼样本都获得了线粒体 DNA 控制区的262bp 序列(15493~15754，去除两端引物)。以 X79547110]作为参考序列进行比对，实验结果见表5。共检测出13个多态性位点，全部为转换，没有颠换、插入与缺失，且转换主要在嘌呤之间，占69.2%(9/13)，显示出较高的多态性。这5个序列中共检测出3个单倍型，EQ16，EQ21 与 EQ24共享同一单倍型。 根据 Jansen 等23]和 McGahern 等124]的关于单倍型类群的划分，基于线粒体 DNA 序列变异模式，本文的3个单倍型可以归属于3个不同的单倍型类群A6，B2和E；根据 Cieslak 等16的单倍型类群划分为A，I和G3； 根据 Achilli 等125的划分标准，则分别为 A'B'C'D，I和D。 将石人子沟遗址古代家马的线粒体 DNA 控制区序列在 GenBank(http：/www.ncbi.nlm.nih.gov)上寻找共享序列，结果见表6。只有 EQ42 找到了与之完全匹配的共享序列，其他两个单倍型找到了与之相差一个位点的共享序列。这些共享序列遍布欧亚大陆，分布于不同的品种中，还包括一些古代样本。 2.2 毛色控制基因的 SNP 位点检测 这5个古代家马样本获得了全部 SNP 变异情况，结果详见表7。在6个基因的8个 SNP 位点MC1R(g.201)， ASIP ( g. 2183 ~2193del)， MATP(g.72)， KIT(g.786)，KIT(g.1120)，SILV(g.1457)，SILV(g.697)和 EDNRB(c.323_333)中，野生型为E/E， A/A， C/C，KM0/KM0， sb1/sb1，z/z， z/z 和ov/ov。在本文的检测中，所有样本的基因型都与野生型不同，但发生变异的仅有 MC1R，ASIP 和 MATP是分别控制栗色(chestnut)、黑色(black)和乳白色(cream)的基因。而 KIT(g.786)， KIT(g.1120)，SILV(g.1457)，SILV(g.697)和 EDNRB(c.323_333)并未发生变异。 控制毛色的基因数量很多，本文仅选择常见的和研究相对较深入的几种毛色控制基因进行检测。根据本文的 SNP 检测结果及其所控制的表型特征， 表5 石人子沟遗址墓葬出土古代家马的线粒体DNA控制区序列情况 Table 5 Polymorphic positions of mtDNA from ancient horses at Shirenzigou site 样品编号 变异位点 单倍型类群 Jansen 等[23]和 McGahern 等[24] Cieslak 等16] Achilli等125] EQ16，EQ21，EQ24 15495C，15521A，15585A，15596G，15602T，15720A，15737C E G3 D EQ20 15495C，15538G，15585A，15600A，15602T， 15650G，15651A，15709T，15720A B2 I I EQ42 15495C，15597G，15602T，15650G，15720A A6 A A'B'C'D 表6石人子沟遗址墓葬出土古代家马样本的共享序列分布情况 Table 6Sequence matches from GenBank using NCBI BLAST 序号 样本编号 数量 共享序列分布* 备注 1 Thoroughbred(1) 相差一个位点，共享序列没有15521G>A EQ16，EQ21，113 EQ24 Northern Europe： Norwegian Fjord (1)； Thoroughbred (3)； India： Gujarat， Kathiawar：Kathiawari(1)； India Zanskar valley， J & K： Zanskari pony (1)； China： ancient (1)； 相差一个位点，共享Romanian Draft Horse(1)；East Asia (1)； Kazakhstan：Akhal-Teke(1)； China Jinggouzi 序列没有15585 G>Asite， Inner Mongolia：ancient (1)； China：Tibetan(1)； No breed：(1) 11 India：Gujarat， Kathiawar：Kathiawari(1)； Iceland(1)； Turkey (1)； China：ancient (1)； 相差一个位点，共享Mongolia(1)；East Asia(1)； Botswana(1)； Ireland： Kerry Bog Pony(3)； No breed：(1) 序列没有15596 A>G 相差一个位点，共享 1 Welsh Pony(1)序列没有15600 G>A 2 EQ20 1 Japan：Kiso native horse(1) 相差一个位点，共享序列没有 15651 G>A China：Xinihe(1)； Black Forest(1)； Turkey (2)； Ukraine： ancient (1)；East Asia (1)； Portugal：Pin3ias (1)； Mongolia(1)； EQ42 17 Japan： Noma native horse (1)； Lithuanian Heavy完全匹配 Drought(1)； Kazakhstan： ancient (1)； Pura Raza Espanola (1)； Arabian (2)； Garrano (1)； Lipizzan(1)； No breed：(1) *括号中数字表示找到的共享序列的数量 表7 SNP检测结果及家马样本毛色的基因型与表型特征* Table 7Results of SNP types，genotypes and phenotypes for all eight SNPs 样本 MC1R ASIP MATP KIT KIT SILV SILV EDNRB 毛色 编号 g.201C>T g.2183~2193del g.72G>A g.786G>C g.1120T>A g.1457C>T g.697A>T c.323_333TC>AG EQ16 e/e A/a C/C KM0/KM0 sb1/sb1 z/z z/z ov/ov 栗色 (chestnut) EQ20 e/e A/a C/cr KM0/KM0 sbl/sb1 z/z z/z ov/ov 金黄色 (palomino) EQ21 ele A/a C/C KM0/KM0 sb1/sb1 z/z z/z ov/ov 栗色 (chestnut) EQ24 e/e a/a C/C KM0/KM0 sb1/sb1 z/z z/z ov/ov 栗色 (chestnut) EQ42 E/e A/A C/C KM0/KM0 sb1/sb1 z/z z/z ov/ov 枣色(bay) *有灰色阴影的基因型表示至少有一个等位基因的位点与野生型不同 结合已有的关于家马毛色基因的研究17，13~19]，我们对石人子沟遗址古代家马的毛色进行推测：EQ16，EQ21和EQ24这3例个体应该为栗色(chestnut)，EQ42应该为枣色(bay)， EQ20 应该为金黄色(palomino)。 3 讨论 3.1 线粒体DNA 研究 关于马的线粒体DNA 单倍型类群划分及命名，最早是 Vila 等1261将马划分为A~F共6个谱系。Jansen等23进一步细划，在系统发育图中定义了17个主要的单倍型类群，并指出有一些单倍型类群与特定的品种或地域具有一定的联系。McGahern等124)在此基础上进行了补充，提出了新的单倍型类 群A7和F3，发展为19个单倍型类群。此后 Cieslak等6和 Achilli 等125]对马的分支进行重新划分和定义，尽管与 Jansen 等231和 MeGahern 等24]在线粒体DNA单倍型类群的命名上有所不同，但是基本上可以对应。为方便叙述，本文仍采用 Jansen 等23]和McGahern 等24]的命名原则，即19个单倍型类群，归属于A~G共7个谱系。在现代家马群体中谱系A，D 和F的分布频率较高，而谱系 B， C，E 和G的分布频率普遍较低。 本文检测到的3个线线体 DNA单倍型分别归属于谱系A， B和E。谱系A在整个欧亚大陆的家马群体中都具有较高的频率，B在中亚地区的家马中具有相对较高的分布频率51；而E主要分布在现在的冰岛、设得兰群岛和 Fjord 的矮种马中[23]。 表8谱系E在中国古代家马中的分布 Table 8Haplogroup E found in Chinese ancient domesticated horse 遗址 数量 比例 样本 GenBank NO. 年代 参考文献 丰台遗址 2 2/3 Fen 1 FJ204377 样本 Fen 1 的C年代为 2695±30aB.P.，校正年代为 [6] Fen 3 FJ204379 905~800BC；样本Fen 2~4的年代为1000~800 BC 新店子遗址 2 2/12 HX09 HX13 EU931592 EU931595 2500aB.P. [5] 井沟子遗址 1 1/4 LJM23 DQ900927 C：2115±65aB.P. [4] 在 Cai等14.51和 Cieslak等16关于中国古代家马的线粒体 DNA 研究中，除宁夏于家庄遗址外，谱系A在其他遗址中均有分布；谱系B仅发现1例个体，位于宁夏于家庄遗址的 YJZ01(GenBank NO.：EU931607，频率为1/2；年代为2500aB.P.)；E仅发现5例个体，2例位于青海互助县丰台遗址，2例位于内蒙古新店子遗址，1例位于内蒙古井沟子遗址(表8)。 综合已有研究成果14-6]和本文结果来看，除于家庄遗址(样本量太小，仅有两例，分别属于谱系B和F)外，谱系A在中国各遗址古代家马群体中都有分布，它在揭示中国古代家马“迁移”历史中的作用有限，因此在这里不作讨论。谱系B仅发现在于家庄遗址和本文研究的石人子沟遗址，这两个遗址都位于中国的西北地区，目前为止，在中国其他地区尚未发现。结合B在中亚地区家马中具有相对较高分布频率的特点，本文推测中国早期家马中的谱系B可能是从西方传人的。 除石人子沟遗址外，在丰台遗址6、新店子遗址[和井沟子遗址[4也发现有少量的谱系E的家马，但是谱系E 在石人子沟遗址中的数量是最多的，所占比例为3/5，也只有同样位于西北地区的丰台遗址(2/3)略高于它。E的出现率在西北地区要远远高于其他地区，并且在中国境内由西向东呈递减的趋势。在现代家马群体中，E在欧洲的频率相对较高。新疆石人子沟和青海丰台遗址家马中谱系E较高的出现率可能暗示着它们和欧洲家马有着更密切的联系。与谱系B相似，本文推测中国早期家马中的谱系E也是从西方传专的。 在属于谱系E的这几个古代样本中，石人子沟遗址的 EQ16，EQ21 和 EQ24仅与丰台遗址的Fen 1， Fen 316]或井沟子遗址的 LJM234相差一个位点，相差的位点为15585 或15596，这两个位点都为经常发生回复突变的突变热点。说明它们之间的母系亲缘关系非常近。此外丰台遗址的 Fen 3 与井沟子遗址的 LJM23 共享有相同的线粒体DNA 单倍 型，二者年代相近、丰台遗址略早于井沟子遗址，推测 Fen 3 与 LJM23 有着相近的母系来源。 从年代上来看，除井沟子遗址4外，于家庄遗址51新店子遗址[5]和丰台遗址61都早于石人子沟遗址，说明石人子沟遗址发现的谱系B和E并不是中国发现最早的，虽然这些古代家马在母系遗传上最早源于中亚或欧洲，但是可能很早的时候已经到达中国境内，并逐渐向各地扩散了。 值得注意的是石人子沟遗址家马中谱系A的比例并不高，相对地不常见的谱系E有很高的比例。也许本文的小样本量不允许我们做更多的解读，但是我们可以清楚地看到石人子沟遗址家马具有相对较高的线粒体DNA 遗传多样性。这是因为在古代当地生活高度依靠马匹，不同谱系和不同品种的家马从中亚地区不断交换至此，其遗传多样性自然得到增加。这也正好反映出该遗址所在的新疆地理环境便于东西方文化交流。 古代文献记载汉武帝派张骞通西域，开拓丝绸之路，以及中亚地区盛产不同品种的良马。《史记·大宛列传》记载“大宛之迹，见自张骞。0…大宛在匈奴西南，在汉正西，去汉可万里……多善马，马汗血，其先天马子也。”27《汉书·张骞李广利传》中也有关于汉武帝派人攻打大宛取其宝马的历史记载[28]。大宛国是古代中亚的国家。丝绸之路是西汉时由张骞出使西域开辟的以长安(今西安)为起点，经甘肃、新疆，到中亚、西亚，联结地中海各国的陆上通道。新疆位于欧亚大陆中部，地处中国西北边陲，在古代是丝绸之路必经之地。新疆石人子沟遗址的年代又与汉武帝统治时期相近。结合古代文献记载和新疆的特殊地理位置，本文推测随着丝绸之路的开通，新疆作为其重要一段，在中国家马发展过程中引进西方品种、丰富中国家马的多样性方面发挥着重要的地理作用，支持新疆是家马引入中国的一个重要通道。至少到汉武帝时期，中国西北地区特别是新疆起着家马“东输”的“中介”作用。 3.2 家马的毛色研究 毛色研究与线粒体 DNA 分析有着不同的研究意义”。在古代，人们可以有意识地选择不同毛色的家马，但是却无法人为地选择线粒体 DNA，所以从某种意义上讲，毛色研究可以更有效地帮助我们重建家马被“选择”的历史。 马匹毛色为马匹毛发身上呈现的颜色，现已定义的毛色有十多种，如包括未定义的毛色，会超过一百种，其中黑色、枣色、栗色和灰色为主要的马匹毛色。毛色由不同的显性基因 MC1R， KIT 等所控制，另有稀释基因 ASIP ， MATP 等将原毛色产生不同变化形成各种新的毛色[12-19，29]。 Ludwig 等对欧亚大陆发现的大量古代马的毛色进行了 SNP 检测，其年代从旧石器时代、新石器时代/红铜时代、青铜时代到铁器时代，包括西伯利亚、东欧、中欧、伊比利亚半岛、东亚等多个考古遗址。他们成功地检测出其中的89匹古代马的毛色，认为最早的野生型的毛色为暗褐色(dun)。更新世晚期至全新世早期西伯利亚和东欧地区野马的颜色是枣色(bay)或枣色到暗褐色之间(bay-dun)；而伊比利亚全新世早期的野马在 ASIP 基因上具有非黑色和黑色两种等位基因，当时的野马中有枣色(bay)与黑色(black)两种毛色。进人距今5000年以来，在西伯利亚与东欧地区毛色的多样性迅速且持续地增加。在其研究中有4匹家马(Fen1~4)来自于中国青海省互助县丰台遗址，Fen1的毛色是枣色带有有斑(bay Tobiano)，其他3匹马是枣色(bay). 新疆石人子沟遗址的家马中共检测出栗色(chestnut)、枣色(bay)和金黄色(palomino)3种不同的毛色。与年代相对较早的丰台遗址相比，石人子沟遗址的家马毛色增加了栗色(chestnut)和金黄色(palomino)两种，毛色相对多样。毛色多样性高与线粒体 DNA 相对较高的多样性一致，推测当时在该地区可能汇集了家马的不同谱系和品种。 虽然毛色可能是人们选择马匹时的诸多因素之一，但在特殊情况下可能是一个重要因素。本文采集的石人子沟遗址的5匹家马中，有3匹来自同一墓葬M12[8]。M12属中型墓，封堆西侧发现殉牲坑3座，分别殉有1匹骆驼和2匹马。墓室内随葬品丰富，同时葬有一匹马。殉牲坑内的两匹马都是栗色(chestnut)，属于家马中常见的毛色；而墓室内殉葬的马是金黄色(palomino)，与殉牲坑内的栗色马 不同。显然，极其少见的金黄色马与墓主人同葬于墓室，应该是当时特殊的选择，推测金黄色马可能具有特殊的地位，或与墓主人生前有着特殊的关系。游牧文化性质的石人子沟遗址，马匹在生产生活中发挥着重要作用。而大量的马匹被殉葬的现象又反映出马在当时人类社会祭祀、信仰中的重要地位。 古DNA 研究为我们提供的金黄色毛色的识别仅仅是DNA 分析的一个简单应用。但是当这个简单的毛色识别与该匹马特殊的殉葬方式结合分析的时候，我们发现金黄色马与人之间可能存在特殊的关系。该分析表明，占 DNA 研究与考古学的紧密结合，可以帮助我们获取古代人类社会中独特的信息，为考古学研究提供新的研究思路和线索。就古代家马的 DNA 研究来看，需要有更多的古代家马样本，使用更多的 DNA 遗传标记进行分析，才能更加深入地了解人与马的互动关系，这将是我们今后工作的重点。 4 结论 通过对新疆石人子沟遗址的墓葬中出土的家马进行线粒体 DNA 和毛色控制基因的核 DNA 分析，并结合古代文献记载和新疆所处的特殊地理位置，得出以下认识： (1)DNA分析揭示石人子沟遗址家马具有相对较高的线粒体 DNA 和毛色的遗传多样性。该遗址具有游牧文化性质，高度依靠马匹，及其特殊的地理位置，便于在此汇集不同谱系和不同品种的家马。随着丝绸之路的开通，新疆作为其重要一段，在中国家马发展过程中引进西方品种、丰富中国家马的多样性方面发挥着重要的地理作用，支持新疆是家马引入中国的一个重要通道。 (2)毛色控制基因的核 DNA 研究不仅显示出石人子沟遗址家马毛色多样性较高，还揭示了人与马匹之间复杂的文化现象。该遗址中的家马具有栗色(chestnut)、枣色(bay)和金黄色(palomino)3种不同的毛色，其中极其少见的金黄色马的出现并与墓主人同葬于墓室，可能是当时特殊的选择。家马可能被赋予了特殊的文化内涵，它在古代人类社会中具有着重要的地位。 ( 致谢 感谢新疆文物考古研究所、西北大学文化遗产与考古学研究中心，为本研究提供了宝贵的样本；感谢审稿专家建设性的修改意见。 ) ( 参考文献(References) ) ( 1 Mashkour Marjan ed. 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DNA was successfully extracted from five ancient horse samples indedicated ancient DNA labs following vigorous protocols for maximal contamination prevention. Both mitochondrialDNA (mtDNA) and single nucleotide polymorphic (SNP) markers for coat colors were targeted for PCRamplification. The results show a high success rate(100%) of DNA recovery due to the superior DNA preservationconditions in the region. The mtDNA reveals three haplotypes belonging to three haplogroups(A，B and E) while theamplified SNP markers indicate three different coat colors(chestnut， bay and palomino). While the sample size is relatively small，it is clear that the analyzed remains have a high genetic diversity asdemonstrated by both the mtDNA and SNP results. The relatively recent antiquity of the horse remains and thenature of the archaeological contexts strongly indicate that these skeletal remains represent domesticated horsesinstead of wild horses. Although this study cannot provide any direct evidence as to how these remains are linked toolder horse remains in Central China， it is clear that the remains analyzed did not originate from Central China.These results are consistent with the hypothesis that Chinese domesticated horses were imported via Xinjiang ofNorthwest China. The high genetic diversity of the analyzed horse remains in this study can be adequately explainedby the fact that this geographic region represents an easy exchange area for horses traded in from other regions. One extremely rare coat color of palomino(light golden color)was detected in this study，marking the first timeit has been reported in ancient horses. It is worth noting that the horse skeleton with the palomino coat was buriedtogether with a human skeleton，while two other chestnut colored horse skeletons(a common coat color) were buriedin sacrificial pits (animals only). While more studies are needed to fully understand this burial practice，it is clearthat horses must have played extremely important roles in human life then. This study demonstrates the unique contribution that ancient DNA analysis can make， when combined witharchaeology， to our understanding of human-animal interactions in the past. Ancient DNA in this study reveals notonly a high genetic diversity of ancient horse populations but also a rare coat color that is found to be associated withspecial cultural implications in the region. Key words Shirenzigou site， domesticated horses，ancient DNA， coat color 新疆石人子沟遗址出土家马的DNA研究 作者：赵欣，Antonia T Rodrigues， 尤悦，王建新， 马健，任萌，，袁袁靖，杨东亚作者单位：赵欣，杨东亚(中国社会科学院考古研究所，北京100710；加拿大西蒙菲莎大学考古学系古DNA实验室，温哥华， V5A 1S6)，Antonia T Rodrigues(加拿大西蒙菲莎大学考古学系古DNA实验室，温哥华，V5A 1S6)，尤悦(首都师范大学历史学院，北京，100048)，王建新，马健，任萌(西北大学文化遗产学院，西安，710069)， 袁靖(中国社会科学院考古研究所，北京，100710)刊名：第四纪研究?ISTICPKU英文刊名：Quaternaryy Sciences年，卷(期)：2014，34(1) ( 参考文献(29条) ) ( 1. 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