植物性海产品中6种合成色素检测方案(固相萃取仪)

PreeKem 全自动固相萃取-液相色谱法检测植物海产品中的6种合成色素 编号：PLAET1401 摘要：本方法参考《GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定》标准，结合实际情况优化实验条件，用乙醇/氨水/水(7：2：1)提取植物性海产品中的合成色素，溶剂浓缩后用20%柠檬酸调pH至6，应用 EXTRA全自动固相萃取仪，使用聚酰酰柱分离、净化，淋洗液经浓缩、转换溶换定容后，供 HPLC-DAD检测，外标法定量分析。 关键词：：合成色素，柠檬黄，苋菜红，靛蓝，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝， EXTRA， HPLC 引言： 合成色素主要指用人工合成的方法从煤焦油中制取或以笨、甲苯、萘等芳香烃化合物为原料合成的有机色素，其性质稳定，着色力强，因此被广泛使用。研究发现合成色素多具有致癌性。常见的合成色素有，柠檬黄，苋菜红，靛蓝，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝等。 近年来，采用高效液相色谱检测人工合成色素时，未见有对植物性海产品中人工合成色素的检测。为了配合食品安全监督，本文参考 《GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定》标准，结合实际情况优化实验条件，用乙醇/氨水/水 (7：2：1)提取植物性海产品中的合成色素，溶剂浓缩后用20%柠檬酸调 pH至6，应用EXTRA 全自动固相萃取仪，使用聚酰胺柱分离、净化。 选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，免人工干预，，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤，释放了大量实验室劳力。收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换定容后，以高效液相色谱仪(HPLC-DAD)完成了饮料中中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝等6种合成色素含量的测定。 苋菜红 OH SONa 日落黄 靛蓝 1.试剂、仪器及器材 1.1试剂 甲醇(HPLC)：经0.5um 滤膜过滤。 甲醇/甲酸(6：4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL， 混匀。 20%柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H807·H20)， 加水至100mL， 溶解混匀。 乙醇/氨水/水(7：2：1)：量取无水乙醇 70mL，氨水 20mL， 水10mL，混匀。 乙酸胺溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL， 溶解，经0.45um 滤膜过滤。 1.2仪器及器材 全自动固相萃取仪 EXTRA(上海屹尧)、安捷伦1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、超声波清洗仪、电子天平、超纯水机、高速离心机、氮吹仪、移液枪、C18色谱柱(4.6X250mm，5um)、 聚酰胺小柱(500mg/3mL) 2.实验方法 2.1 提取 称取 0.2g紫菜(精确到 0.001g)样品于 50mL离心管中，加入25mL乙醇/氨水/水(7：2：1)，涡旋混匀，超声提取 30min， 10000r/min， 离心3min，收集上清液，再次加入 15mL 乙醇/氨水/水(7：2：1)进行提取， 重复上述步骤，直至提取液无明显颜色。收集所有提取液，80℃氮吹浓缩至 5mL 左右，用20%柠檬酸溶液调pH值到6. 2.2净化 5mL水活化→上样→8mL甲醇/甲酸(6：4)淋洗 8mL水林洗 8mL乙醇/氨水/水(7：2：1)洗脱 2.3分析 洗脱液在80℃下氮吹至干，用水定容至1mL， 经0.45um 滤膜过滤后用 HPLC 分析。 2.4仪器条件 2.4.1 EXTRA 净化程序 EXTRA净化程序如表1所示： 表1EXTRA净化程序 动作 位置 溶剂 体积(mL) 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 6 120 120 活化 水 5 20 2 上样 样品溶液 5 20 2 清洗 外针 水 120 120 稀释 水 5 20 15 上样 样品溶液 5 20 2 空气 0.5 60 60 甲醇/甲酸(6：4) 8 20 5 淋洗 水 20 5 空气 60 60 洗脱 乙醇/氨水/水(7：2：1) 20 2 2.4.2色谱条件 进样量：10uL；柱温：35℃；流速：11.0mL/min， 检测波长范围及梯度洗脱程序分别如表2、表3所示： 表2 DAD 检测波长范围 时间(min) 设定值(nm) 参考值(nm) 0 450 800 2.3 560 800 3.5 516 800 4.7 620 800 5.4 530 800 6.8 560 800 表 3 HPLC梯度洗脱程序 时间(min) 甲醇% 0.02mol/L 乙酸铵溶液% 0 10 90 3 65 35 6 98 2 2.5标准曲线 移取一定量的三种色素标准储备液配置如表4所示浓度混合系列溶液，进行高效液相色谱分析，以峰面积与标准系列溶液浓度进行线性回归。 表4标准曲线浓度表 苋菜红 胭脂红 诱惑红 柠檬黄 靛蓝 日落黄 亮蓝 储备液浓度 (mg/mL) 1.03 0.500 1.016 0.999 0.550 1.018 0.500 1(mg/mL) 0.00824 0.0206 0.008128 0.007992 0.0088 0.008128 0.004 2 (mg/mL) 0.0206 0.01 0.02032 0.01998 0.022 0.02036 0.01 3(mg/mL) 0.02884 0.014 0.028448 0.027972 0.0308 0.028504 0.014 4(mg/mL) 0.0412 0.02 0.04064 0.03996 0.044 0.04072 0.02 3.结果与讨论 3.1色谱图 通过高效液相色谱分离，利用 DAD 检测器检测，在2.4.2色谱条件下，标准溶液、加标样品和空白样品的色谱图如下所示： 图3紫菜空白样品、加标样品、混标色谱图 由图中可以看出，7种人工合成色素保留时间重现性良好，样品经净化后无明显干扰。 3.2标准曲线回归方程 将混合标准系列溶液在2.4.2色谱条件下进样分析，以混合系列标准溶液浓度为横坐标(Area)，，以相应峰面积为纵坐标(Amt)进行线性回归。回归方程及相关系数如下表所示： 表4标准曲线回归方程及相关系数 组分 回归方程 相关系数 柠檬黄 Area=31398.8318*Amt+0.9920026 0.99997 苋菜红 Area=30550.8316*Amt+3.1085856 0.99999 靛蓝 Area=27821.3048*Amt-7.8794578 0.99881 胭脂红 Area=29576.7432*Amt+1.8647016 0.99998 日落黄 Area=32181.0987*Amt+2.7224202 0.99998 诱惑红 Area=39381.5732*Amt-3.2976384 0.99998 亮蓝 Area=99526.3295*Amt+2.7359565 0.99997 3.3加标回收率、相对标准偏差 在 0.2g 空白样品中添加适量三种色素的标准混合液，平行三份，进行加标回收实验。加标回收率、相对标准偏差如下表所示： 表5回收率及精密度实验结果 组分 本底值 加标值 平均测定值 RSD (n=3) 平均回收率% (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) 柠檬黄 0 0.007992 0.00702 2.53 85.59 苋菜红 0 0.00824 0.00574 1.11 69.66 靛蓝 0 0.00880 0.00130 3.04 14.77 胭脂红 0 0.00400 0.00316 1.99 79.00 日落黄 0 0.008144 0.00670 0.74 82.27 诱惑红 0 0.008128 0.00627 0.45 77.14 亮蓝 0 0.00400 0.00322 0.09 80.50 3.4讨论 3.5.1本方法适用于大批量样品的同时检测，样品量大，所以本实验采用了 EXTRA 全自动固相萃取仪进行净化处理，免人工干预，自动完成SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤。全自动固相萃取仪采用正压技术控制液体流速，保证液体传送的准确性和重现性，从而避免了重复的人工操作及人为误差， 并且能够确保良好的重现性和精确性，便于方法的实验室间转移，也便于建立行业乃至国家的实验室标准。 3.5.2由于靛蓝对柠檬酸、酒石酸及碱不稳定，而本实验中使用到柠檬酸及碱，所以本实验中靛蓝回收率相对较低且不稳定，所以本实验不适宜于靛蓝色素含量测定。 3.5.3净化前调pH至酸性时，所选用的酸不能对聚酰胺柱子产生影响。本文做过实验比对，用甲酸和20%柠檬酸调 pH 后进行净化时发现，用甲酸调pH至酸性的样品上样时色素在小柱上扩散很严重，，上样还未完成时已经扩散至柱子底端，并且用甲醇/甲酸(6：4)进行淋洗除杂时，会有少量色素被洗出。而用20%柠檬酸调节 pH至酸性的样品上样时未发生扩散，仍在柱子顶端。 4.结论 由于国标中人工合成色素检测方法中没有包括植物性海产品，为了配合食品安全的监督，本文参考国标中人工合成色素的前处理方法，加以改进，采用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱法同时检测植物性海产品中的6种人工合成色素：苋菜红、胭脂红、诱惑红、柠檬黄、日落黄、亮蓝。该方法抗干扰性强，具有较高的灵敏度，回收率符合要求，精密度 RSD 值也都较小。因此本方法能同时检测植物性海产品中6种合成色素，可为食品管理部门提供可信的依据。 ( 参考文献 ) ( [1]GB/T 5009.35-2003《食品中着色剂的测定》 )