蜂产品中农兽药残留检测方案

Agilent 6410 LC/MS串联四极质谱分析蜂蜜中的氯霉素 由于农、兽药的残留可引起人类的癌症、畸形、抗药性及某些中毒现象，所以国家对食品安全极为重视。美国 FDA 公布的禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，具体包括磺胺类药物，1999年10月开始，欧盟对不少磺胺类抗球虫药也颁布了禁令。氯霉素(CAP)是一种高效广谱抗生素，在美国、加拿大和欧盟，氯霉素严禁用于产肉动物，蜂蜜和动物饲料中。其浓度应在 0.3 ppb以下。 在目前所有的检测氯霉素残留的方法中， LC/MS/MS 以其无须衍生化，样品的制备简便，灵敏度高等特点而成为氯霉素残留的主要测试方法。为了满足越来越高的检测要求，需要开发出与之相应的检测方法， LC/MS/MS 成为其最有效的方法之一。 而采用电喷雾负离子模式，以五氘代氯霉素作为内标，可以校准由于样品提取过程以及基质带来的误差。应用内标法，可以准确的定量检测 50 ppt的浓度。样品经过固相萃取，流动相只用甲醇水以减少质谱的维护频率。 实验 试剂 ( Agilent AccuBond SPE ENV PS DVB 萃取柱 (P/N 188-3060) ) ( 乙酸乙酯 (Burdick and Jackson， Morristown，NJ) ) ( 甲醇 HPLC 级(Burdick and Jackson) ) ( 水(18MW) Milli-Q级 ) ( 氯霉素(C A P)(Aldrich Chemical C o. Milwaulkee， WI) ) ( 氛代氯霉素(d5) CAP 内标(Cambridge Isotope ) ( Laboratories CIL，Andover， MA， U.S.)针头式过滤器(0.2 ccm， PTFE) (Agilent P/N ) ( 方法概述 ) 内标配制 1.A 100-og/mL (100 ppm) CAP-d5标准甲醇溶液购自 Cambridge Isotope Laboratories， Inc.(Lot SCCE-005) 2.以甲醇 1：100 稀释得到1 g/mL (1 ppm)或1000 ng/mL CAP-d5 的内标溶液 ( 3.再以甲醇1：100 稀释得到(用于加入样品中) 10 ppb CAP-d5的内标溶液 ) 4.每一克样品加入25 oL CAP-d5 内标溶液，使得内标最终浓度为 0.25 ppb 标样制备 1.称重，以甲醇溶解制备 100-og/mL标准 CAP溶液， 5.0 mg CAP 加入 50 mL甲醇 2.以甲醇1：100稀释得到1 g/mL (1 ppm)CAP 3. 加入25 L CAP-d5 稀释液 4.配制：1 ppb，0.2 ppb， 0.1 ppb， 0.02 ppb，和0.01 ppb，内标浓度为 0.25 ppb 样品制备 所有 SPE 小柱用2mL活化 1.蜂蜜，1g样品用5mL水稀释并加入25。10 ppb 内标液。此溶液转入 SPE 小柱放置 5 min 后以 10 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。40℃氮吹挥干溶剂，残渣以1mL甲醇超声 1 min 溶解。以针头式过滤器过滤，进样分析。 2.虾，1g虾样解冻混混，加入3 mL水和 25L10 ppb 内标液，离心5 min (8，000 rpm)。上清液上柱静置5min， 以5 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。40℃氮吹挥干溶剂，残渣以1mL甲醇超声1 min 溶解。以针头式过滤器过滤，进样分析。 LC/MS条件 液相色谱为 Agilent 1200-SL 二元泵带自动进样器。质谱为 Agilent 6410 LC/MS 三重串连四极杆质谱。参数如下： 表1. LC/MS条件 HPLC 色谱柱 ZORBAXSB-C18， 2.1x50 mm， 1.8 ocm(p/n827700-902) 流量0.4 mL/min流动相A： 水B：甲醇 梯度 0-5 min， 30~70%B 5-6min，70~100% B 8 min，100% B 后运行时间 4 min柱温 45℃进样体积 5 odLMS源设置离子源 ESI极性 负极性 干燥器温度 350℃ 干燥器流量 10 L/min 雾化器压力 45 psi 毛细管电压 3500V Fragmentor 100 V 碰撞能 m/z 257(定性离子)10V m/z 152(定量离子)15V 表2.结构及碎裂离子 CAP and CAP-d5 (*CAP-d5 内标氛代位置) 结果及讨论 谱图质量及标样灵敏度 表2列出了鉴定计分系统中所用氯霉素的结构和用于定量和确认的碎片离子[6] 为得到最高灵敏度，只需优化仪器的两到三个参数，即fragmentor电压，以获得母离子最高的传输效率；碰撞能，以使得定量、定性离子信号最强，以及 Vcap 毛细管电压，保证产生最大的离子数目。 质谱条件优化 图1结果随 Vcap 的变化，此参数的影响很小，只在3，500Ⅴ时有少许增加，最后采用此值。 fragmentor 变化范围为90 V-160 V， 120V以上，可观察到碎片离子并且母离子信号明显降低。160V时，没有m/z 321离子观察。结果表明，fragmentor 100 V时，母离子信号最强。最终，用子离子扫描测母离子 m/z 321随不同碰撞能(CE)的变化，碰撞能自2V，5V，8V， 10 V， 15 V，18V直到40 V 比较提取离子色谱图，表明定量离子m/z 257在碰撞能10V，定性离子m/z 152在碰撞能15V响应最大。在这两个能量时子离子质谱图见图二和图三。如表三所示代内标用相同的碰撞能。 图2. product ion spectrum of m/z 312 10 V collision energy. Compound Transition Dwell time Fragmentor Collision MS2 (ms) Voltage(V) Energy(V) resolution CAP 321-257 200 100 10 Unit 321-152 200 100 15 Unit CAP-d5 326-262 200 100 10 Unit 326；-157 200 100 15 Unit 重现性 用蜂蜜基质加标 0.1 ppb 为例，进样提取物 15次。表四为样品及内标的定性、定量离子的峰面积。每个离子的平均峰面积波动为8%，离子比率变化 为5%，远低于离子比率50%可波动20%的要求。Masshunter 定量软件可列表这些结果并给出图示如图四。 Table 4. Integrated Areas of the Quantitation Ion and Qualifier Ion and Their Associated Internal Standard Ion Chloramphenicol d5-chloramphenicol Quantitative Qualifier Ratio Ratio Quantitaive Qualifier Ratio ion(321-152) ion(321-257) ion(326-157) ion(326-262) 350 165 47.1 262 121 50.4 2 346 157 45.2 258 114 55.3 3 346 158 44.6 259 118 49.4 4 313 164 52.3 267 127 47.6 5 301 154 49.5 261 121 46.4 6 313 168 53.6 253 124 49.0 7 320 160 50.1 228 111 48.6 8 326 145 44.5 225 113 50.4 9 317 141 44.5 241 117 48.6 10 290 135 46.6 226 107 47.1 11 300 138 46.2 253 90 45.7 12 281 136 48.4 240 90 47.6 13 303 143 47.3 220 101 45.9 14 290 140 48.3 214 107 49.8 15 261 131 50.3 217 101 46.6 RSD8.11% 8.30% 5.91% 7.67% 9.99% 4.83% 图4. Panels A and B show the CAP and IS peak for the quantitation transition. Panels C and D are the graphic representationof quantitation ion and qualifier ion ratio as shown by MassHunter software. 线性 该方法测定了溶剂标样和基质标样线性， 自10 ppt 至1 ppb，包括了低于要求最低性能限 (MRPL) 和更高浓度。图5至图8为线性图示， r2 均大于 0.999。 图5. Linearity of CAP in solvent from 10 ppt to 1 ppb. 图6. Linearity of CAP in honey from 10 ppt to 1 ppb. 图 7. Linearity of CAP in shrimp from 10 ppt to 1ppb. 图8. Linearity of CAP in chicken from 10 ppt to 1 ppb. 灵敏度 回收率 10 ppt 溶剂标样，进样量5，可得到很好的灵敏度。 MRM 色谱图见图9.尽管这已展现了仪器的灵敏度，但测定真实样品基质中的灵敏度仍很重要。图10为加样 10 ppt， 进样5的色谱图。不仅可测到分析物，而且离子比率仍在允许范围之内。 回收率的测定，是将氯霉素加入到三种样品基质中，之后用指定的 SPE 柱萃取分析。表5是萃取和分析的重现性以及平均回收率。提取前加入内标，会自动校准回收率。因此，方法的定量准确度非常好。回收率的结果表明方法总体有效。 Abundance vs. Acquisition Time (min) 图9. MRM chromatogram of 10 ppt CAP in solvent with injection volume of 5 o. Honey Shrimp Chicken (n=3) (n=3) (n=3) RSD (%) 6.29 3.93 3.29 Recovery (%) 89.5 85.4 86.4 本方法所述的在三种基质中的氯霉素的分析表明，方法有效，可满足低于 0.3 ppb MRPL 下的定量和确认。方法优化简便，仅需调整质谱仪的几个参数，另外可满足认证方法的要求，包括灵敏度，重现性和回收率。安捷伦6410 LC-MS/MS 串联四极杆完全适合分析氯霉素. References ( 1. Chemical Safety Information from Intergovern mental Organisations (IPCS-INCHEM)， Web page http：//www.inchem.org/documents/jecfa/ jecmono/v33je03.htm ) ( 2. S . Turnipseed， et al. (2002) Confirmation of Multiple Phenicol Residues in Honey byElectrospray LC/MS， Laboratory Information Bulletin (4281) U.S . Food and Drug Administration. ) 3. A. Pfenning， et al. (2002) Confirmation ofMultiple Phenicol Residues in Shrimp byElectrospray LC/MS， Laboratory InformationBulletin (4284) Food and Drug Administration. 4...B. K. Neuhaus， et al. (2002) LC/MS/MS Analysisof Chloramphenicol in Shrimp， LaboratoryInformation Bulletin (4290) Food & DrugAdministration 5.P.Mottier， V. Parisod， E. Gremaud， P. A. Guy，and R. H. Stadler.Determination of theantibiotic chloramphenicol in meat andseafood products by liquid chromatography-lectrosprayionization tandem massspectrometry. Journal of Chromatography A2003，994，(1-2)，75-84. 6. Commission， E.， 2002/657/EC： Commission Decision of 12 August 2002 implementing CouncilDirective 96/23/EC concerning the performanceof analytical methods and the interpretation ofresults (Text with EEA relevance)(notified under document number C(2002) (3044)2002.