食品中氨基酸检测方案(液相色谱仪)

柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸 氨基酸是食品中的重要的营养物质，氨基酸的种类和数量是衡量食品营养价值高低的重要指标，目前，关于氨基酸的检测方法有氨基酸分析仪测定，高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法分离度高，选择性好，并分为柱前衍生方法和柱后衍生方法。常用的柱前衍生方法有邻苯二甲醛( OPA) 、丹酰氯、9-芴甲基氯甲酸酯、2,4-二硝基氟苯等。本文采用天津兰博高效液相色谱系统，以2,4-二硝基氟苯作为柱前衍生剂，对18种氨基酸进行测试，结果表明该方法简便，准确，可以满足日常检测。 1 测试条件 1.1 仪器 分析型高效液相色谱仪（HPLC），由AS1000自动进样器，Lablliance Series 二元高压泵、DAD检测器和Lablliance色谱工作站组成，配一支氨基酸测试专用色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm, 5 um)；AXM-8 Temp.柱温箱。 1.2试剂 18 种氨基酸标准对照品：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸( Glu) 、组氨酸( His) 、丝氨酸( Ser)、精氨酸 (Arg)、甘氨酸( Gly) 、苏氨酸( Thr) 、脯氨酸( Pro) 、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val) 、甲硫氨酸(Met) 、胱氨酸 (Cys) 、异亮氨酸(Ile) 、亮氨酸(Leu) 、赖氨酸(Lys) 、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)，牛磺酸，纯度≥99%，美国Sanland公司；2,4-二硝基氟苯，上海国药集团化学试剂有限公司进口部；乙腈为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂为分析纯。 1.3标准溶液配制 分别称取适量的18种氨基酸的标准品，用0.1mol/L HCl定容于10 mL容量瓶中，得到浓度均为500 mg/L的混合标准溶液。 1.4氨基酸衍生方法 取100uL标准溶液或样品水解液于1.5mL EP管中，加入缓冲溶液(pH=9.0) 200 uL 300ng/mL 2,4-二硝基氟苯100 uL，漩涡混匀，于90℃恒温水浴锅中避光反应 90 min，反应结束后加入10%( v/v) 乙酸50 uL，调pH为中性，以水定容至1.00 mL，混匀，取上清液过0.45um有机膜后，待测。 1.5 色谱条件： 色谱柱：Kromasil (4. 6 mm × 250 mm, 5 um)，天津兰博实验仪器设备有限公司；流动相 A为乙腈; 流动相B 为乙酸+乙酸钠缓冲液( 0.03 mol/L 乙酸钠溶液，加入0.15%三乙胺，再用冰乙酸调pH为5.25±0.50； 柱温：40℃； 检测波长：360nm； 流量：1mL/min； 进样量：10uL； 梯度洗脱程序见表： 时间(min) A% B% 流速（ml/min） 0 18 82 1 10 18 82 1 15 29 71 1 25 35 65 1 28 53 47 1 35 58 42 1 38 18 82 1 42 18 82 1 2测试结果： 2.1检测波长的选择 氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应后的衍生物对紫外光可产生吸收。采用二极管阵列检测器对各氨基酸衍生物紫外光谱扫描，结果表明，氨基酸衍生物的最大吸收波长大多数在360 nm左右，故实验采用360 nm作为检测波长。 2.2流动相 pH 的选择 在相同流动相梯度条件下，考察了缓冲液pH4.00～7.00时的色谱分离情况，比较了在不同 pH 时氨基酸保留时间的变化，结果表明，在 pH5.20～5.30之间 18种氨基酸的分离较好。最后选定缓冲液范围pH 为5.25±0.50。 2.4方法性能指标 以氨基酸峰面积为纵坐标Y，氨基酸的质量浓度为横坐标X，对测得的数据进行直线回归。线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限见表1。结果表明，被测氨基酸在此质量浓度范围内，经衍生化后生成的氨基酸峰面积与氨基酸质量浓度呈线性关系。标准色谱图见图 1 表1 18种氨基酸的线性方程、相关系数及线性范围 化合物 回归方程 相关系数/r 线性范围/(mg.L -1 ) 检出限/(mg.L -1 ) 天冬氨酸 Y = 24.6354 X + 0.1396 0.9991 2.5～50 0.25 谷氨酸 Y = 21.6725X - 5.4021 0.9985 2.5～50 0.38 组氨酸 Y = 21.0632 X+11.7984 0.9985 2.5～50 0.50 丝氨酸 Y = 22.4573 X-17.9246 0.9987 2.5～50 0.55 精氨酸 Y = 13.5495 X+12.4697 0.9992 2.5～50 0.94 甘氨酸 Y = 28.1196 X - 35.9328 0.9989 2.5～50 0.46 苏氨酸 Y = 23.2687 X-36.1256 0.9993 2.5～50 0.39 牛磺酸 Y = 25.2279 X -21.4731 0.9989 2.5～50 0.34 脯氨酸 Y = 7.3094 X + 12.5836 0.9994 2.5～50 1.21 丙氨酸 Y = 39.8197 X - 8.6837 0.9998 2.5～50 0.13 缬氨酸 Y = 33.2924 X - 10.8219 0.9997 2.5～50 0.34 甲硫氨酸 Y = 21.2148 X + 12.3469 0.9989 2.5～50 0.39 胱氨酸 Y = 3.9094 X -7.2081 0.9996 2.5～50 0.33 异亮氨酸 Y = 30.6983 X -1.6594 0.9985 2.5～50 0.34 亮氨酸 Y = 31.4870 X – 9.2571 0.9991 2.5～50 0.38 苯丙氨酸 Y = 23.5972 X + 2.9418 0.9987 2.5～50 0.29 赖氨酸 Y = 19.7843 X +0.7539 0.9996 2.5～50 0.30 酪氨酸 Y = 3.9452 X -1.7643 0.9989 2.5～50 1.98 注: 以峰高 3 倍于基线噪声所对应浓度为检出限。 图1 18种氨基酸标准品的高效液相色谱图 3 结论 采用2,4-二硝基氟苯作为衍生剂的柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸的含量，操作简便易行，准确可靠，可满足日常分析。