氨基酸中柱前衍生高效液相色谱法检测方案(液相色谱仪)

·140· ·141·色谱 1993年第11卷第3期 柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸 梁冬生 常碧影 (国家饲科质量监督检验测试中心，北京，100081) 自从Moore 等一提出色谱法定量分析氨基酸以来，传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方法始终占着主导地位。三十多年来，人们对该法及仪器做了大量的研究与改进工作，使分析的灵敏度、速度以及自动化程度有了很大的进步21，而且以此为基础，建立了食品、饲料等有关氨基酸分析的一系列国际和国家标准。然而，随着氨基酸分析应用领域的扩展，氨基酸测定仪用途单一、结构复杂、价格昂贵等缺点日显突出。自七十年代以来，随着高效液相色谱的发展，特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生技术的发展，为氨基酸分析提供了广阔的前景.目前不少方法已趋于成熟，并且逐步被临床化学、蛋白质化学、生理研究以及食品、饲料营养分析者所认可与采用。这些方法大多具有衍生操作简洁，不产生或易于排除干扰物、色谱分离分辨率高，灵敏度高，分析时间短以及仪器简单、也可一机多用等优点。但也有各自的欠缺与不足。本文就是根据我们的经验及有关的文文74.53，对目前应用最广、影响最大的几种柱前生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法--—邻苯二甲醛(OPA)法、氯甲酸芴甲酯(或叫9-防基甲氧基羰酰氯FMOC)法、异硫氰酸苯酯(PITC)法和丹酰氯(即二甲氨基萘磺酰氯，Dansyl-Ci)法进行讨论和研究，介绍它们的基本原理、特点，列出各自的色谱图和有关数据(与离子色谱法比较)等。 一、邻苯二甲醛(OPA)法 邻苯二甲醛(OPA)衍生法，早在1971年就由Roth提出，由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍，故最初作为一种柱后衍生剂，后来才作为柱前衍生剂使用。Jones等提出的衍生方法如下： SSR OPA 在2-巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，加成物可产生 荧光，在紫外区有较强吸收。它可做高灵敏度荧光检测，又可做一般的紫外吸收检测。紫外检测线性范围为10--200pmol，荧光为0.8--15pmol。OPA本身不干扰分离与检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也比较平稳。图1为 OPA 衍生法定定蛋白水解液的色滚图. OPA 柱前衍生文相HPLC 法比传统柱后衍生有更高的分辨率和灵敏度。多数氨基酸检测极限为0.5pmol(以信噪比2.5：1计)，只有组氨酸和赖氨酸较高，分别2.5和3.5pmol.OPA 法蛋白水解液变异系数一般为2--3.4%(CV)，生理体液为4-7%(手动衍生 off-line)，酪氨酸和组氨酸的大些，为8--10%。表1给出了 OPA等方法测定结果与理论值的比较。 OPA 法最大缺点是：1.不能与带有仲氨基团的脯氨酸或羟脯氨酸反应，因此做全谱分析时需配以其他技术(如与FMOC衍生剂一起使用).2.赖氨酸及胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低，近年来有人提出加 Brij35和碘乙酸酯使其灵敏度提高。3.OPA的氨基酸不稳定，特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快，此法多用于全自动的在线衍生(on-line)4. OPA 法分析配合饲料氨基酸回收率较低，这可能是配合饲料中的盐分影响了衍生101. 二、氯甲酸芴甲酯(9-芴基 甲氧基羰酰氯，FMOC) 氯甲酸甲酯是多肽合成的氨基保护剂。它能与带有伯、仲氨基团的氨基酸反应，生成衍生物可被反相高压液相色谱分离。衍生物又具有荧光(也有紫外吸收)，使FMOC逐步成为一个氨基酸分析中新型柱前衍生剂。该方法是 Josefesson提出的，反应式如图3所示。 FMOC 与氨基酸反应迅速，室温下约30s即可完成。反应产物稳定，在4C避光条件下可储存13天之久，在酸性条件下也可稳定30h以上。反应有很高 图1 OPA 法蛋白水解色谱图 图2 FMOC法蛋白水解液色谱图 分析柱为 Superpac 3um ODS I 4. 0×125mm；淋洗液为A：12.5mmo. Na白POpH7.2，B：50：50乙腈和淋洗液A，流速： 1. 2ml/min；检测为荧光 Ex330nmEm450nm；柱温为室温. 柱为 Merck Superspher CH-8 4um 4.0×125mm 加预柱；淋洗液A：20%乙腈 0.5%四氢吠喃，50mmol/LNaAc pH4.2，B：80%乙，50nmNaAc pH4.2；流速1.25ml/min；检测：荧光Ex263nm Em313nm；柱温45℃. 1. Asp，2. Giu，3. Ser，4. Gly，5. Thr，6.His，7. Ala.8. Arg，9.Tyr，10.Val，11.Met，12. Ile，13. Phe，14. Leu，15. Lys，16. Pro，17.Fmoc-OH.18.Nor--Va1，19.NH；，20.Cys. 图3 MOC与氨基酸反应式 表1 蛋白水解液(6moi/L HC1 24h)理论值与测定值比较(参考文献[26) 氨基酸 溶菌酶(L.sozyme) 胶原(Collagen) 理论值 柱后衍生 住前衍生 IEC Dansyl-Cl Ninhydrin OPA OPA PITC FMOC Asp 21 20.6 20.6 22.2 19.0 20.7 46 45.8 The 7 6. 6 6. 9 7.1 7.2 7.4 16 15.5 Ser 10 8.9 9.4 10.0 8.9 9.5 47 34.7 Glu 5 2.5 2.5 1.6 2.1 1. 6 68 69.1 Pro 2 1. 5 不反应 不反应 1.6 1.2 107 109.7 Gly 12 13.1 12.7 14.1 13.1 12.9 348 358.8 Ala 12 11.6 12，4 12.2 11.9 12.8 95 86.9 Cys 8 7.1 AmA 4.2 3 Val 6 4.8 4.8 4.9 5.8 4.9 13 16.6 Met 2 0.3 0. 1 0.2 7 4.3 Ie 6 5.0 4.7 5.4 5.8 5.9 13 13.9 Leu 8 7.8 7.6 8.1 10.0 9. 4 16 22.9 Tyr 3 2.8 2.7 2.8 2.9 3.0 2 2.1 Phe 3 2.9 2.6 4. 2 4.9 3.6 8 11.2 His 1 1.3 1.0 1.0 0.9 1.1 7 5.9 Lys 6 6.6 4.1 8.0 5.8 7. 0 30 25.7 Arg 11 11.0 11.0 11.2 11.5 11.0 50 48.3 的灵敏度，检测极限为1pmol(信噪比为2.5：1)，可与OPA 法相媲美。色谱分离中有很好的分辨率和分离速度12.18]FMOC 法最大优点是不受样品基质的干扰(如盐分)。图2为 FMOC 法分析蛋白水解液色谱图。 FMOC法蛋白水解液的结果变异系数一般为2-3%，只有组氨酸变异系数较大，为8一9%，生理体液变异系数为3-5%，测定结果均与传统离子色谱法和理论值相近(见表1)。 FMOC 柱前衍生反相 HPLC 法的缺点是，FMOC 在衍生过程中易产生试剂的水解反应，过量的 FMOC与其水解产物均有和FMOC-氨基酸类似 的荧光，一般需在上机前萃取净化。最近 Betnerll提出采用1-氨基金刚烷(ADAM)与过量 FMOC试剂反应，生成衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰，这就排除了试剂峰的干扰。该技术的应用，无疑使该法衍生步骤简化，且易于实现在线自动化。 三、异硫氢酸苯酯(PITC) 作为Edman试剂 PITC 最初广泛用于多肽及蛋白质序列分析，1982年Koop16提出用 PITC(Ed-man试剂)分析氨基酸，Heinrikon和 Bidlingmey-erl181完善了方法的衍生步骤，反应如下： R、 S计 -N=：C= s+ NH，-CH-Coo-一 NH-C-NH-CH一COO- PITC 作为柱前衍生试剂，它可以和一、二级氨基酸反应，在室温下仅十分钟即可完成，反应产物在原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收，使得能够用紫外检测器(254nm)检测。一般说来，PITC-氨 基酸结构稳定，在室温下放置数小时、冰箱中放置数周后分析，都可得到良好的结果。图4是采用 PITC衍生法分析蛋白水解液色谱图。 图4 PITC 法蛋白水解液色谱图 图5 Dansyl-C1法氨基酸标准色谱图 分析柱为 Superpac 3um ODS I 4.0×125mm 加预柱； 分析柱Spherisorb ODS I 3um 4.6×125mm 加预柱；淋洗液A：12.5mmol/L Na2POpH6.4，B：50：50乙腈 淋洗液A：3%四氢呋喃，15mmol/L Na2PO：pH6.3，B：和缓冲液A，流速为1.5ml/min；检测为紫外254nm 60%乙腈，15mmol/L Na2POpH6. 3，流速1.2ml/min；0.08AUFS；柱温为38℃. 测为荧光Ex330nm Em550nm，柱温为室温. 1. Asp，2. Glu，3. Ser，4. Gly，5. Thr，6. Ala，7. Pro，8. His，9. Arg，10. Tyr，11. Val，12. Met，13. Cys，14. Ile，15.Leu，16.NH3，17. Phe，18. Lys，19.Tau，20.Dansyl-OH，21.Trp，22. (Cys)2，23. (Gly-Cys)2，24. (Ala-Cys)2，25.Orn. PITC柱前衍生反相HPLC 法有很好的分辨率和较短的分析时间，但最初的一些报道指出 PITC方法的再现性低于茚三酮法，如果样品存在非挥发性盐类和洗涤剂，都会使结果受到影响[19，尤其对天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和赖氨酸影响最大。但 最近几年研究已经证明 PITC 方法准确性可以和ICE 法相媲美。现今 PITC 衍生法已广泛应用于生物材料、饲料及食品分析中[20，213。 PITC 法分析蛋白水解液中氨基酸的变异系数一般为2一4%，生理体液为3一5%，但组氨酸和胱氨 酸稍大，分别为6%和10%。表1给出 PITC 法与理论值及 ICE 方法的结果比较。 但是该方法也具有三个劣势：1.氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂，使得 PITC法很难实现操作全部自动化；2.PITC-氨基酸不具有荧光，不能给出高的灵敏度，检测极限为50pmol，仅为OPA 法和FMOC 法的1/50；3.值得注意的是使用PITC 易于降低柱寿命，Furst等人提出在有保护柱情况下，一根色谱柱可令人满意地分析800 FMOC、700 OPA 和500 Dansyl-C1，而尽管在严格的真空净化和样品制备条件下，最多只能分析150个 PITC样品，这可能是由于存在痕量的PITC 衍生剂造成成。 四、丹酰氯(二甲氨基萘磺酰氯 Dansyl-Cl) Dansyl-C1 原是检测一、二级氨基酸的著名荧光剂，生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱分离[22：23]，衍生是按照 Tapuhi2提出的方法进行的： Dansyl-Cl 衍生方法比较简单，尽管一些报道说衍生物产率决定于 Dansyl-C1与氨基酸比例，但经Tapuhi 等改变一些条件后，解决了这一问题，最适合的比例一般为5：1一10：1。 Dansyl-C1 与氨基酸反应时间比较重要，在室温及避光条件下需35分钟左右。反应产物转化率与反应时间关系很大，而且温度升高可以加速产物转化，但最高不可超过60℃，否则 Dansyl-C1会发生水解，反而使产物转化率降低。图5为 Dansyl-C1法测定氨基酸的标准色谱图。表1给出了 Dansyl-C1 法测定结果与离子色谱法比较。 Dansyl-Cl 法检测极限与 OPA和FMOC 法相当，线性范围一般在15-150pmol，相关系数为0.993，回收率为95一105%，平均为97.6±5.1%。 Dansyl-C1分析氨基酸的优点是：1.衍生物比较稳定，一般可放置12一24小时；2. Dansyl-C1 胱氨酸衍生物线性关系好，它是目前上述四种柱前衍生法中唯一可以定量测定生理体液中胱氨酸的方法。但Dansyl-Cl法也有许多不足：1.反应时间必须严格掌握；2.衍生产物对紫外光照比较敏感，故反应要在避光条件下进行，特别是蛋氨酸衍生物对光相当敏感，回收率往往很低；3.易生成多级衍生物，如赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物。 综上所述，以上四种柱前衍生定量测定氨基酸 的万法，各有其独到之处。分析蛋白水解液四种方法大约都需20分钟，检测极限：OPA≈FMOC>Dansyl-C>PITC，衍生物稳定性：PITC≈FMOC>Dansyl-C1>OPA，衍生所耗时间：FMOC≈PITC>Dansyl-Cl>OPA. 从仪器设备上讲，均采用两元梯度淋洗，需要两台高压液相色谱泵，紫外或荧光检测器等。分析柱多采用反相 C18柱，FMOC 法以反相C柱居多。从仪器生产厂家看，惠普公司和吉尔森公司采用 OPA 与FMOC 结合法[25]， Waters 公司则建议采用 PITC法，并推出了专用的氨基酸分析柱 Pico-Tag 及衍生工作站，LKB公司则认为 OPA、FMOC和 PITC三法均可使用。在实际应用中，OPA 和FMOC 在生理体液中应用较多，而在食品和饲料工业中 PITC 法占主导地位。据 Furst 统计结果表明，每年采用OPA法大约分析8000个生理体液样品，FMOC、PITC 和Dansyl-C1 法则为5000一6000个。 ( 参考文献 ) ( [1] ]s S. Moore，D. H. Spackman，W.H. Stein，Anal. Chem.， 30，1185(1958). ) ( [2] ] c C. De Jong，G. J. Hughes，E. Van Wieringen，K. J. Wil-son，J. Chromatogr. ， 241，345(1982). ) ( [3] J. C. Giddings et al.，“Advance s in Chromatography" Vol. 22，Marcel Dekker Inc. ，New York，P. 37，1983. ) ( [4] ]G G. McClung，W.T. Frankenberger，Jr.，J. Liq. 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Biochem.，127，49(1982). ) (收稿日期：1992年1月3日，修回日期：5月24日) Pre-column Derivatization Methods for the HighPerformance Liquid Chromatographic Determination ofAmino Acids Liang Dongsheng， Chang Biging， China NationalCenter for Quality Superrision and Test of Feed， Beijing，100081 Reversed-phase high performance liquid chroma-tography has become a powerful method for assayingamino acids in biological material， food and feed. Fourpre-column derivatization methods with O-phthal-dialdehyde (OPA )， 9-fluorenylmethyl chloroformate(FMOC)，phenylisothiocyanate(PITC) and 1-dimethyl-aminonaphthalene-5-sulphonylchloride (dansyl-Cl)，were compared and evaluated. Special attention is paied to the comparison of ac-curacy， sensitivity， reproducibility and resolution withion-exchange chromatography method. In this paper wealso give some typically chromatogram and summarizecharacteritics of each methods.