扫面电镜观察胆结石的微观结构

电 子 显 微 学 报Journal of Chinese Electron Microscopy Society第21卷第6期2002年12月Vol-21，No.62002-12 890电子显微学报 J. Chin. Electr. Microsc. Soc.第21卷 文章编号：1000-6281(2002)06-0889-04 胆结石的微观结构和组成元素研究 刘 刚，刘剑虹吴 杰，杨海珉 (1云南师范大学分析测试中心，云南昆明650092；2昆明医学院基础部，云南昆明650031) 摘 要：用扫描电镜研究了胆色素型和混合型胆结石经氯仿、乙醇、乙醚、盐酸等溶剂溶解剩余物的微观结构，结果显示色素型结石难溶物为膜孔相连结构，两层膜之间填充颗粒状盐；混合型结石难溶物的微观结构为絮状物连接的网孔结构，盐类嵌镶在絮状物中。用X射线能谱仪和等离子体发射光谱仪分析了胆结石的元素，讨论了金属元素在结石中所起的作用。 关键词：胆结石；扫描电镜；元素分析 中图分类号：R575.62；Q336 文献标识码：A 胆结石是一种世界性的常见病和多发病，且发病率还呈增加趋势，目前尚无有效的预防和治疗药物。胆结石的发病机理研究已成为当代医学的重要问题之一。对胆结石已进行了多方面的研究。利用扫描电子显微镜对胆结石的形貌结构进行了较多的研究，Kaufman 等用扫描电镜的背散射电子成像观察胆结石的形貌，用能谱仪分析结石中的钙盐；Kodaka等利用背散射电子像和X射线微区分析技术分析取自同一位患者的15个胆结石的形貌及钙盐分布差异；Lim等用扫描电镜检测乙醇与两种溶剂甲基叔丁醚(MTBE)和 EDTA混合使用对胆红素钙结结的溶解能力；Loginov 等”采用彩色阴极发光扫描电镜分析胆结石中胆固醇、胆红素及蛋白质的分布，并通过透射电子显微镜观察含胆固醇区域的超微结构；Abe等用冰冻蚀刻制样，用透射电子显微镜观察胆固醇结石的超微结构； Kaufman 等用扫描电镜和无窗能量色散X射线显微分析仪研究黑色结石和棕色结石中钙盐的分布；Konikoff 等°则用低温透射电子显微术观测胆汁中脂类凝聚的显微结构；郭绍红等用透射电镜对人胆汁中胆固醇单水结晶的形成过程进行了研究；王爱勤等用扫描电镜和能谱仪对色素类结石进行了结构和组成的研究；夏亮芳等研究了丫结石中的矿物成分；我们对胆结石的磁性进行了初步研究，以解释胆结石的磁疗机理。 虽然对胆结石的结构和组成进行了较多的研究，但迄今胆结石的组分还没有彻底弄清；胆结石中各组分的微观形貌及其结合状态知之不多，金属元素在结石中的作用和结合状况也知之很少。有必要 ( 收稿日期：2002-03-26 ) 对胆结石的组成和结构进行深入研究。在本文中我们用扫描电镜观察了胆结石及胆结石经氯、乙醇、乙醚溶解抽提胆固醇、胆红素和脂溶性物质后的难溶物的微观结构；用X射线能谱仪和等离子体发射光谱仪对胆结石进行了元素分析，探讨了金属元素与胆结石形成的关系。 实验与方法 胆结石样品由昆明医学院附属第一医院提供，均为手术从胆囊取出。取出后用水冲洗、凉干待用。每例选一粒从中间切成两半，根据外观形貌、剖面结构及红外光谱结果定性。 胆红素钙的制备参照胆红素铜的制备方法胆固醇和胆红素购自 Sigma公司，其它都为分析纯试剂。 1.1 扫描电镜观察 用双面胶带将结石固定在样品台上，镀金，用扫描电镜(KYKY-2000B 型)观察剖面结构，加速电压为20kV。将切开的一半胆结石用氯仿-乙醇(体积比为1：1)浸泡，抽提溶解液，再用乙醚-乙醇(体积比为2：1，V/V)溶解，抽提液体得一次难溶剩余物。再将所得剩余物用10%的盐酸溶解两次，抽去溶解液，用三蒸水置换；凉干剩余物，再分别用前两组试剂抽提一次，得难溶物。取胆结石难溶物少许喷金，用电镜观察难溶物的形貌结构。 1.2 能谱分析 将胆结石剖面向上用导电胶固定在扫描电镜样品台上，喷碳膜，将样品放入扫描电镜样品架观察，用X射线能谱仪对结石剖面作微区元素分析，能谱 仪为 TN-series Ⅱ能量色散X射线微区分析系统，分辨率为150eV，扫描电镜所用的加速电压为20kV。 1.3 微量元素分析 取胆结石样经浓硝酸、高氯酸消化，用美国BAIRD PS-4型电感耦合等离子体发射光谱仪进行元素分析。 2 结果与讨论 2.1 胆结石的微观结构 胆固醇型结石外观淡黄或灰白、灰黄，表面光滑，剖面呈放射状条纹，中心有少量色素物质。图1为胆固醇型结石的典型微观形貌，红外光谱分析显示该结石成分主要为胆固醇。层板状(或长棒状)的胆固醇结晶平行堆积成一组，一组堆积与另一组之间以斜交连接；胆固醇层之间有空隙，可能为含水成分，在真空中挥发留下空隙。在胆固醇层间也散见颗粒状物，为胆红素钙等盐类。 色素型胆结石外观为泥沙样或不规则形，大小不一，棕红或棕色、黑色、深绿色，剖面呈层状，无核心。色素型胆结石的微观结构复杂得多，既有块状胆固醇结晶体的无规堆积，也有大量盐类颗粒的堆积，还观察到图2所示的细条状缠绕物。在化学合成的胆红素盐中观察到如图3所示的丝条状结构，我们认为，细条状物为胆红素盐聚合物。 色素型胆石经氯仿-乙醇、乙醚-乙醇溶解后的形貌结构如图4，出现了大的空洞，空洞边沿及洞与洞之间由薄膜状物相连，两层膜之间有大量球形颗粒物堆积。红外光谱结果显示难溶物含大量磷酸盐和胆红素盐，我们认为这些颗粒物为磷酸盐。 混合型结石常为多面体、深绿色或棕黄色，剖面像树的年轮状。图5为混合型胆结石经氯仿-乙醇抽提再经乙醚-乙醇溶解后的微观结构，结石出现了空洞，空洞间为絮状物连接，也可见膜状物。红外光谱显示含有大量碳酸盐和胆红素盐，从微观结构看，碳酸盐等嵌镶在絮状物中。 Malet等用等离子体氧蚀刻处理色素型结石，证明黑色胆红素石和黑色磷酸盐结石中有蛋白质的网状结构。我们认为色素型胆石和混合型结石难溶物中的膜状物为蛋白质。胆结石中的膜状结构对结石的形成可能起关键作用。 2.2 胆结石的元素分析 图6为胆结石的典型的能谱图。我们测试了36例胆石，其中混合型2例，色素型6例(其中1例为黑色结石)，胆固醇型28例。共检测出钠、镁、铝、 硅、磷、硫、氯、钾、、铁铜、锰等元素，不同结石检测出的元素及含量有差异。金属元素一般以盐的形式存在于胆结石中。在黑色色素结石中书出铜，说明黑色胆结石中铜的含量比其它类型结石高，提示铜盐(主要为胆红素铜)对黑色结石可能起重要作用。 在所有结石的核心都检测出钙和元素，多数结石中测出磷元素。磷与磷酸盐有关，结石中的钙元素与钙盐有关，钙的相对比例远比磷的高，说明除了磷酸钙外，钙还以其它盐的形式存在；其它金属元素也可能以盐的形式存在。硫元素一般与蛋白质有关115]，说明钙盐和蛋白质在结石的成核过程中起作用。对于胆固醇结石，核心钙高于周边；色素型结石没有明显差异；混合型结石核心的钙高于中间部位和周边。 对胆固醇型、混合型、色素型结石各选一例用等离子体发射光谱做微量元素分析，样品经浓硝酸消化处理，用美国 BAIRD PS-4型电感耦合等离子体发射光谱仪进行元素分析。表1为测试结果。 表1 月结石微量元素含量(ug/g 样品 Ca Na Mg P S Fe Cu Zn Mn Ni 28# 856.9 1205 305.8585.8226.846.12 23.9 8.866.60 10.9 3# 81053264576.33843 413.860.319.812.383.9 11.2 4#A 43742 3580 528.6940.7365.3102.7 29.2 12.8 31.3 5.96 4#B10405 1155416.71190289.033.223.27.7630.9 9.93 样品 Ba Sr Mo Pb Se Co As Cd A1 28 11.42.652.02)2 11.690.1050.34 0.37 0.077 <0.02 3# 15.07.092 2.49 1.67 0.09 00.620.46 0.068 <0.02 4#A 15.887 7.14 1.06 1.36 0.05 0.240.19 0.037 <0.02 4#B 10.83.471.53 1.541 0.0960.29 0.40 0.068 <0.02 注：*误差较大。表中：28#样为胆固醇型结石，3#样为棕色色素型结石，4#为混合型结石，4#A为4#样的核心，4#B为4#样除核心外的其余部分。 从表1可以看出，胆石中含量在1ug/g以上的有、钠镁、磷、硫、铁、铜、锌、锰、镍、锁、锶、钼、铅等14种元素，在1ug/g以下的有硒、钴、砷、镉。混合型结石核心钙、钠、硫、铁比周边高。色素型和混合型结石、钠、镁、磷、硫、锰铁、锌高于胆固醇结石，其它一些金属元素也较高；提示金属元素在色素型和混合型结石的形成过程中可能起着较为重要的作用。 人体必需的常量元素有碳、碳、氧、氮、钠、镁、磷、硫、氯、钾、等等11种，人体必需的微量元素有氟、硅、钒、铬、锰、铁、钴、镍、洞、锌、硒、锡和碘等14种116]。在胆结石中，等离子体发射光谱检测出钙、钠、镁磷、硫，加上能谱检测出的氯和钾，人体所必 图1 胆固醇结石的SEM图片(Bar=100pm)；图2 色素型结石中的丝条状物的 SEM 图片(Bar=10pm)；图3 合成胆红素钙中聚合物的SEM 图片(Bar=10pm)；图4 色素型结石难溶物的 SEM 图片(Bar=10pm)；图5 混合型结石难溶物的SEM图片(Bar=10pm)；图 6 胆结石(No.3)的能谱图。 Fig.1An SEM photograph of an cholesterol gallstone (Bar=100um)；Fig.2 An SEM photograph of fibrous materials in an pigmentgallstone(Bar =10pm) ； Fig. 3 An SEM photograph of polymers in synthetic calcium bilirubinate (Bar = 10pm)； Fig. 4 An SEMphotograph of insoluble remains of pigment gallstones after dissolution with chloroform ethanol and etherethanol (Bar=10um)；Fig. 5 AnSEM photograph of insoluble remains of mixed gallstones after dissolution with chloroform ethanol and ether ethanol (Bar=10um) ；Fig.6Energy dispersive spectrum of gallstone. 需的常量元素在胆石中都有。人体必需的微量元素大多也存在于胆结石中。 过渡金属元素由于其多价位，可能对结石的形成起特殊作用。金属元素在体内大多与一些酶蛋白有关，如锌酶，锰超氧化物歧化酶，铜蓝蛋白铜超氧化物歧化酶等。金属蛋白代谢的主要途径是通过 肝脏分解并分泌胆汁进行的。胆汁中有未结合胆红素，胆红素能与钠离子、钙离子、镁离子、铜离子、锌离子、锰离子等结合成胆红素盐；胆红素与金属形成的盐具有非化学计量的性质13，15]，即金属离子不仅可结合到胆红素的羧酸根上，而且还与吡咯环上的氮、氧形成络合物。因此，胆石中的胆红素金属盐难 于被一般溶剂溶解。胆汁中还有有肪酸、碳酸根、磷酸根，它们会与金属离子形成不溶脂肪酸钙、碳酸钙、碳酸镁、磷酸盐等。 在胆结石中钙的含量非常高，说明钙比其它金属起的作用大。磷酸钙沉淀比可溶钙更强烈地刺激胆固醇结晶的形成，胆汁粘蛋白和磷酸钙沉淀导致模拟胆汁中胆固醇快速完全晶晶。钙离子能与蛋白质结合形成多价位复合物；胆汁中的蛋白质如酸性糖蛋白带大量负电荷，能很容易地与胆汁中的阳离子结合；因而，在胆汁中极有可能形成脂类-蛋白质-Ca -胆红素复合物，出现蛋白淤积，从而为胆结石成核提供基质。其它物质如胆固醇、胆红素盐、脂肪酸盐、磷酸盐、碳酸盐等填充到基质或结合到基质上，从而慢慢形成胆结石。 关于金属元素尤其是镁、铜、锌、铁、锰等过渡金属元素在结石中所起的作用有必要深入研究。 3 结论 色素型胆结石经氯仿、乙醇、乙醚溶解后难溶物的微观结构出现了大量空洞，空洞间为膜状物相连，两层膜间填充了大量磷酸盐、胆红素盐等盐类颗粒。混合型结石溶解后出现了絮状物连接的空洞，碳酸盐、胆红素盐等盐类填充在絮状物中。胆结石中的膜状物或絮状物形成结石的网架结构。 在结石的核心都检测出钙和硫元素，胆固醇型结石核心钙高于周边，提示钙盐和蛋白质在结石的成核过程中可能起重要作用。金属元素在色素型和混合型结石的形成过程中可能起着较为重要的作用。 ( 参考文献： ) ( 术文献出版社，1998.249-309. ) ( [ 2 ] K aufman H S， L i llemoe K D， Magnuson T H ， et a l .Scanning Microscopy， 1 9 90， 4 ： 8 5 3-862. ) ( [ 3 ] Kodaka T ， M o ri R ， De b ari K， et al. 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The ultrastructure of the insolublematerials of mixed stone whose cross section looks like tree rings with holes connected by floc materials in which salts were embedded. Thechemical elements in gallstones were investigated by energydispersive Xray microanalysis and inductively coupled plasma atomic emissionspectrometry. The relationship between the metallic elements and the structure and the formation of gallstones was discussed. Keywords： gallstone；SEM；element analysis ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net