大鼠中脑片制备检测方案

第5期 吉林 医 药 学院 学报 Vol.34 No.52013年10月 Journal of Jilin Medical College Oct. 2013-326 第5期 刘志洋，等.探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法—327 第34卷 及发光特性，并对西藏大花红景天中的红景天苷进行了提取及定性、定量分析。结果表明，荧光分光光度法不仅具有仪器操作简单，灵敏度高等优点，而且适用于复杂试样的分析，尤其是分离比较困难的中药材中荧光物质的分析。值得关注的是，试样必须进行适当的稀释，否则容易发生荧光猝灭效应而导致荧光消失。红景天苷提取液的成功分析为我国中药材的质量评价提供了重要的分析依据。 ( 景天苷的含量[].分析试验室，2008，27(z1)：305- 306. ) ( 5] 张 群，傅尔康，齐发顺.重氮化比色法测定红景天苷含量叨.中国医院药学杂志，1998，18(4)：167-168. ) ( 6] 王运科，伟忠民，李盈，等.薄层扫描法测定红景天保健食品(口服液)中红景天苷的含量[].锦州医学院学 报，2006，17(4)：44-46. ) ( [7] 韩 梅.HPLC-荧光检测法测定雪域红景天口服液中红景天苷的含量[].华西药学杂志，2005，20(5)：441- 442. ) ( 参考文献： ) ( [8] 程子毓，洪美花，陈元涛，等.恒温超声波法提取红景天根中红景天苷的工艺及含量测定研究].青海师范大 学学报：自然科学版，2008(3)：80-82. ) ( [] 明海泉，夏光成，张瑞均.红景天研究进展[].中草药， 1998，19(5)：37-41. ) ( 9] 包文芳，吴维春，李葆华.抗疲劳药用植物红景天[M].北京：人民军医出版社，2004：134-136. ) ( 2] 陈亚东，曹秀兰.高山红景天对小鼠耐缺氧、抗疲劳及耐低温作用的影响影.中国中医药科技，2002，9(3)：157- 158. ) ( [10] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：144. ) ( 3] 王中风，吴永娴，曾凡坤.红景天资源的开发利用及前景[.中国林副特产，1997(3)：48-49. ) ( (收稿日期：20 1 2-07-15) ) ( [4] 杨晓艳，芦启琴，张晓峰. HPLC 法测定红景天根皮中红 Cocoe ) 文章编号：1673-2995(2013)05-0326-03 ·论 著· 探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法 刘志洋，王会芳，何海斌，刘 娜，王金萍，彭 雪，王子真，高俊涛* (吉林医药学院，吉林吉林 132013) 摘 要： 目的 探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法。方法 配制人工脑脊液以及切片所用的 cutting液。将2d大的幼鼠断头取脑，用振动切片机将脑切成脑组织切片，然后放入孵育槽内孵育备用。在孵育0.5~1 h后在显微镜下观察细胞的形态结构。结果根据本方法操作，制得的脑组织切片细胞活性较高。结论脑片可以满足膜片钳实验的需要。 关 键建词：脑片；膜片钳；孵育槽 中图分类号：R338.8 文献标识码：A Exploring the preparation of the brain tissue slices applying to patch clampstudy LIU Zhi-yang，WANG Hui-fang，HE Hai-bin，LIU Na， WANG Jing-ping，PENG Xue， WANG Zi-zhen， GAO Jun-tao( Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China) Abstract：：ObjectiveTo explore the preparation method of the brain tissue slices applying to patch clamp study.Methods First，the artificial cerebrospinal fluid and cutting solution should be prepared. After decollating a 2-day- ( 作者简介：刘志洋(1976-)，男(汉族)，讲师，硕士. ) ( 通讯作者：高俊涛(1974-)，男(汉族)，副教授，博士. ) old rat，its brain was transferred into a microtome， which cut the brain into slices (300 pum). Then the brain sliceswere kept in an incubation chamber for 0.5 to 1 hour. Finally，the structures of the brain tissue could be observed un-der a microscope. Results The cell activity in the brain tissue with the method above were higher. ConclusionThe brain tissue can meet the needs of patch clamp research. Key words： brain slice； patch clamp； incubation chamber 有关脑片膜片钳技术最早可追溯至1985年，美国的Gray 和 Johnston 采用酶解撕裂法对豚鼠海马脑片 GABA 受体通道进行了研究。而将膜片钳技术成熟地应用于离体脑片神经元则是1989年，德国马普研究所 Edwards、Sakmann 和日本京都大学 Takahashi首次将微分干涉相差技术应用到膜片钳技术领域，并对大鼠(海马，视皮层，嗅球，小脑，额叶皮层和脊髓等)、小鼠(海马)、猫(视皮层)神经元离子通道特点进行了广泛研究。近年来随着膜片钳技术的日益成熟，利用脑片研究神经细胞的电生理活动具有其独特的优势。其可以保留较完整的纤维联系与空间结构，同时又能排除在体内复杂的因素对其影响，使得研究变得简单化2。因此脑片在研究神经病、癫痫、电生理反应、微管相关蛋白 tau 表达及在各种条件下损伤程度等实验中有重要的应用，脑片培养技术十分重要，脑片的制取和培养也越来越突出了它的重要性。目前，国内已经开始发展幼鼠海马脑片的技术，但可能因为各种不适条件或方法的不同“而产生误差甚至是失败，本文详细介绍一种幼鼠脑片的制备步骤及制备的过程以及可能遇到并需要注意的问题。 材料与方法 1.1 实验动物 新生1~2d的 Wistar 乳大鼠由吉林医药学院实验动物中心提供。 1.2 试 剂 人工脑脊液( artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L)： NaCl 126， KCl 3.0， KH，PO 1.2，NaHCO， 26，CaCl， 2.5，MgCl，3.3。(每250 mL ACSF用量： 10×Stock225 mL； ddWater 225 mL； CaCl，600 p.L；MgCl， 325 p.L)；葡萄糖0.45 g(pH7.4)。 Cutting solution pH 7. 4 成分(g/L)： Cholinechlofide：k167. 5； KCl 1. 94； CaCl， 75uL； MgCl，1050 pL； NaHCO， 21.8； NaH，PO 1.5； Glucose 27；A-scorbate acid 25. 7(每150 mL Cutting solution 用量： 10 ×Stock 15 mL； ddwater 135 mL； CaCl， 75 uL；MgCl，1 050 pL； Glucose 0.405 g； Ascorbate acid 0.039 g) 。瞬间粘合剂(Loctite 404TM 胶)；振动切片机(MA752Motorised Advance Viborslice UK)；脑片孵育槽；恒温水浴锅。 1.3 切片方法 将5%的琼脂块，裁成适当大小，在振动切片机(MA752型，Campden Ins，UK) 标本托上涂上少许瞬间粘合剂(404TM胶)，将修整好的琼脂粘贴在标本托上；制备250 mL ACSF，放在冰箱中，控温于2~4℃，然后取100 mL烧杯，加入80 mL ACSF，通入混合气体(95%0，+5%CO，)饱和，置于36℃的恒温水浴锅中；制备150 mL Cutting soluion，置于冰箱中控温0~2℃，然后在切片槽中，加满 Cutting soluion，并通入混合气体(95%0z+5% CO，)，待各溶液达到指定温度后，使用乙醚麻醉动物。 选用出生1~2d的 Wistar 乳大鼠，乙醚麻醉下迅速断头取脑(留少许小脑，便于将大脑固定在琼脂上)，将剥离好的大脑切平，置于混合气(95%0， +5% CO，)饱和的4℃ Cutting Solution 中，然后取出大脑，平齐放在刀片上，用滤纸吸干 Cutting Solution，在标本托涂上少许瞬间粘合剂(404TM胶)，然后垂直粘贴于在振动切片机标本托上。在4℃和供氧混合气条件下，用振动切片机将海马沿长轴顺横向的纤维走向切成厚为 300 pm 的薄片6~10片。切片时，振动切片机切割速度调在3~4(约0.14 mm/s)，振动频率选9(约3500 r/min) 。然后将切好的脑片置于混合气饱和的 ACSF 中，室温下孵育0.5h待用。 2 结 果 脑片颜色观察可见，健康脑片呈淡黄色，如果脑片变白则表明活性丧失。将制得的脑片放在红外显微镜下观察其形态，可以看出图1细胞的外形轮廓清晰，轴突较为明显，活性较高，而图2由其他方法制备的细胞胞体较大，空泡、轴突消失，活性较差。因此比较得出由此方法制备的脑片活性较高。 图1 细胞活性较好(40×) 图2细胞活性丧失(40×) 3i讨论 脑片的完好制备，尤其是脑片的细胞活性状态是膜片钳实验成功的重要前提基础。本实验通过对大量脑片制备过程的观察，在动物的选择和脑片的制备细节上总结以下需要注意的问题。 动物：一般选择出生1~2d的乳鼠。原因有三：·是幼年动物颅骨软，取脑快，冷却也快；二是幼年动物抗缺氧能力比较强；三是幼年动物脑细胞膜韧性好，易于形成高阻封接，而成年或老年动物细胞脆性较大，颅骨较硬，不易封接和剥离。 麻醉：麻醉剂常用乙醚，其作用短暂，对动物影响较小。采用不使用麻醉剂而直接断头的方法会引起动物的应急损伤，同时不符合动物保护的要求。在本实验中，由于新生动物非常小，也可使用冰冻昏迷法而无需使用麻醉剂。 取脑：取脑时间(从断头到将脑浸入 Cutting Solu-tion 中的时间)对脑片制备影响较大，一般以1~3 min较好。为保证脑片的存活，必须自始至终坚持无菌原则；分离大脑动作要轻柔、迅速，整个分离、切片时间最好应控制在5 min 之内；在本实验中，由于采用全脑切片，冷却时间应控制在30~50s内。 切片(以INVSLM1型振动切片机为例)相关注意事项为：(1)整个切片过程要求无菌操作，所有动物、解剖器具、切片机、浴槽及其他溶液均需消毒处理；(2)振动切片机在切割时刀片的振动频率要尽可能高，但应以刀片不产生垂直振动为准，一般选择振动频率为9((约3500 r/min)；(33)i设定好所要切片的厚度后，务必将刻度盘锁住；(4)对一般脑组织来说，切片厚度在300 u.m 为宜，因为若脑片太薄(<150pm)利于细胞的存活，但如果脑片太厚(>500 p.m)，细胞不易得到充足的氧气，细胞存活率也会降低；(5)加入浴液，一般切片在液面下1 mm 左右深度进行， 液体温度保持在0~4℃，并不断通入氧气混合气；(6)振动切片机在切割时刀片的切割推进速度应尽量慢些，以防止挤压大脑；(7)不同部位的切片的频盆不-样，需要注意；(8)刀刀片片可可采采用.用不锈钢刮胡刀片，装片时要用酒精消毒，且刀片均为一次性使用，切完以后刀片抬高一点，再退刀片，这样对脑片的活性大有帮助。 脑片孵育：(1)孵育的纱网选用尼龙丝袜面料制作，原则是透水性好、质地光滑，脑片不易粘附；(2)采用医用输液器的细塑料管(带有针头)给予氧混合气，为增大气体与ACSF 的接触面积，要将针孔用钳子夹扁，使气体在ACSF 中形成非常小的气泡，同时还可以节省氧混合气(95% 02+5% CO，)；(3)处于孵育中的脑组织，需要在一个稳定的环境下恢复，通入混合气体时，气流不应过大，否则会很容易吹动脑片组织，引起死亡。 ( 参考文献： ) ( [1] 刘振伟.实用膜片钳技术[M].北京：军事医学科学出版 社，2006：168-175. ) ( 2] 康华光.膜片钳技术及其应用[M].武汉：科学出版社， 2003： 1 00-103. ) ( 3] 刘振伟，李立君，刘传绩.海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术.生理学报，2001，53(5)：405-408. ) ( [4] 王勇，朱小南，陈汝筑，等.新生大鼠海马脑片培养方法.中国药理学与毒理学杂志，2005，19(1)：70-74. ) ?China Academic Journal Electronic Publishing House. 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