皮肤神经活检对糖尿病周围神经病的早期诊断价值

丽等 皮肤神经活检对糖尿病周围神经病的早期诊断价值 第24期°3657° 中国老年学杂志2010年12月第30卷°3658° 皮肤神经活检对糖尿病周围神经病的早期诊断价值 凌 丽 薛金伟 刘永丹 (河北大学附属医院，河北色保定 071000) [关键词〕皮肤神经活检；糖尿病周围神经病；诊断 [中图分类号〕上R745.4 文献标识码」A 文章编号J 1005-9202(2010)24-3657-03 糖尿病周围神经病是临床常见多发病，多累及感觉及自主神经系统，其中最易受到侵犯的是广泛存在的小神经经维，而常规体格检查及电生理技术主要检测大直径、有髓鞘神经纤维的功能，不能及时发现小神经纤维损伤的病变；甚至当糖尿病患者已经出现明显临床症状的时候，仍不能通过技术手段对其进行确切的诊断及病情评估。皮肤神经活检作为一种能够准确探测小神经纤维损伤的技术越来越受到人们的重视。本研究首次通过皮肤神经活检对糖尿病周围神经病患者表皮和汗腺神经纤维进行定量和形态学观察，以探讨皮肤神经活检对糖尿病周围神经病的诊断价值。 1 资料与方法 1.1 般资料 糖尿病患者和正常人皮肤标本各43例取自2007年1月至2010年5月在吉林大学第一医院及河北大学附属医院接受皮肤神经活检和在骨科急诊就诊的外伤手术患者。糖尿病患者43例均符合WHO糖尿病诊断标准，男19例女24例，年龄35~75[平均(49.3±141)]岁，病程3~32年，平均13.6年，其中17例平素接受胰岛素治疗，20例口服降糖药控制血糖，余6例未规律用药，血糖控制在 6.6~17.2 mmoyI之正常对照组，男20例，女23例，年龄33~74[平均(48.8±12.2)]岁，两组间性别、年龄无显著差异(P0.05)。所有受试者知情同意，均除外大量饮酒史和神经毒性药物服用史及其他神经病变危险因素接触史、皮肤疾病。 1.2 试剂 碘化乙酰硫代胆碱、TritonX-100.多聚赖氨酸购自Sima公司，兔抗人蛋白基因产物9.5(PGP9.5)多克隆抗体、超敏 S-P9710试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、柠檬酸抗原修复液购自福州迈新生物技术开发有限公司，余所需试剂均由吉林大学第一医院神经内科实验室及我院中心实验室提供。 1.3 方法 1.3.1 皮肤活检及实验方法 选取足外踝上方约10~15 cm ( 1 黑龙江省人民医院神经内科 ) ( 第一作者：凌 丽(1980-)，女， 博 士，主治医师，主要从事周围神经方面 的研究。 ) 处小腿外侧皮肤，常规消毒皮肤，2%利多卡因局部麻醉，在拟取材处行长约1cm的纵行切口，钝性分离皮下组织，留取0.3×10?大小的全层皮肤组织，平均分为两部分，分别投入Zambon固定液中固定及液氮中冷冻。 1.3.1.1 PGP9.5免疫组织化学染色 Zambon定液中常规固定16~24 h后，经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制成蜡块。在石蜡切片机上进行垂直于皮肤表面的连续切片，片厚10um石蜡切片脱蜡、水化后，采用隔水加热法，将切片置于0.01molL柠檬酸缓冲液中，温度控制在95℃~98℃，保持15min进行抗原修复，自然冷却至室温，之后步骤按试剂盒操作规程进行，阴性对照以0.01 moyL PBS代替一抗。以试剂公司提供的胰腺组织内分泌细胞作为阳性对照。 1.3.1.2 胆碱酯酶组化染色 液氮中冷冻后，于恒冷冰冻切片机中切片，片厚10m采用改良 Kamovsky-Rot染色法去行胆碱酯酶染色。冰冻切片自然风干后，经双蒸水充分浸洗，入37C孵育液中孵育1~2h镜下观察染色程度，待汗腺神经呈棕红色即入双蒸水中浸洗3次，每次3min常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 1.3.2 观察指标 1. 3.2.1 1表皮神经纤维的观察 400倍光学显微镜下采用 C5型目镜测微尺对免疫组织化学染色切片进行表皮神经纤维的定量和形态学观察，每个活检标本至少有3张切片参加计数，每张切片轴突数量的评估至少在6个显微镜视野内完成。。以每单位表皮面积中 PGP9.5阳性神经纤维数量表示表皮神经纤维密度(ENFD) ( fibers/mm，每个标本的正IENFD值取其各个显微镜视野平均值。具体参考 Koskinen1)等于2005年在该项研究中所采用的计数原则及计算方法。 1.3.2.2 汗腺神经纤维的观察 光学显微镜下观察胆碱能神经着色情况。每个活检标本至少有3张切片参加测量，每张切片随机选取3个具有汗腺分布的视野进行观察。使用 mageProPlus60图像分析软件对围绕汗腺的神经纤维进行鉴别和定量，结果以神经纤维的面积占汗腺管(包括神经纤维)所占的总面积的百分比表示，并对结果进行分析。 统计学分析，采用 SPSS 11.0统计软件进行分析，数据 用表示，组间比较采用检验。 2 结 果 21 表皮神经纤维的观察 以 PBS代替 PGP95进行染色的阴性对照片无明显着色，呈现阴性反应；以胰腺组织切片的内分泌细胞作为阳性对照，呈现明显的棕黄色沉淀，呈现良好的阳性反应；表皮神经纤维起自于背根神经节的感觉神经，从切片中可见多数表皮神经纤维起自于与表皮平行走形的真皮下神经丛，发出后经过真皮，贯穿基底膜，并且在每个分支处或者以分支的模式垂直地移行并且向上进入表皮，向着皮肤的角质 2 2 汗腺神经纤维的观察 阴性对照不加碘化乙酰硫代胆碱，图片仅呈现苏木素复染的蓝紫色；汗腺组织呈现蓝紫色，为盘旋状不规则球形，支配汗腺的胆碱能神经纤维呈现棕色，以环形密集地缠绕分布在汗腺小管周围，排列及分布较均匀，多呈团簇状分布；与正常人比较，糖尿病组胆碱能神经数量明显减少，分布稀疏，部分汗腺区胆碱能神经纤维消失，染色浅淡，密度不均。见图2 图1 表皮神经纤维的观察结果(PGP9.5染色) 2 3 86例皮肤标本染色定量结果 糖尿病组表皮及汗腺神经纤维密度明显减少，两组之间差异具有统计学意义。糖尿病患者的表皮神经和汗腺神经多有不同程度的损伤，说明其存在不同程度的末梢神经损害。见表1. 表1 两组表皮、汗腺神经纤维密度比较(飞，s n=43) 组别 表皮神经纤维密度 汗腺神经纤维密度 ( fibers/mm) (%) 正常组 367.54±154.37 16.1±3.5 糖尿病组 286.12±189.43 12.4±4.02 3 讨 论 糖尿病周围神经病是临床常见多发的周围神经病，目前已经被广泛研4究.患者往往很难描述自己的神经病变症状。疼痛 hin! 和感觉异常是个人的主观体验，单纯的症状描述作为神经病变的诊断或筛查工具是远远不够的。 目前的临床电生理检查，如神经传导速度和肌电图，只能反映大神经纤维或有髓神经纤维的活动③，而腓肠神经活检有创且对小神经纤维的观察更依赖于电镜。皮肤神经活检作为一种新兴的检查手段，为临床提供了能够对感觉和自主神经进行定量和形态学观察的途径。该技术操作简单、创伤性小4，可多点取材、并有量化的观察指标，直径3mm的一块皮肤即可在光镜和电镜下观察到上皮、汗腺、小血管、成纤维细胞和神经末梢等不同的结构，为临床提供了大量的信息。同时，作为病理检查方法，皮肤活检技术的另一个优越性在于可以定量，与用改良的总体神经病评分判定的神经病状态比较，皮肤活检的敏感性为45%，特异性为97%6，阳性预见性可达92%，阴性预见性为90%，可用于确定临床表现和电生理无阳性发现的周围神经病的存在，而且与腓肠神经活检相比，皮肤神经活检对小纤维神经病变更敏 感. Shun等8通过皮肤神经活检研究发现糖尿病小神经纤维病变常伴有ENFP减少，而且与糖尿病患者的热感觉阈相关，他们还发现皮肤的去神经化程度随糖尿病病程的延长而加重。Sumne等在足部烧灼痛的特发性神经病中有糖耐量异常的病人中，通过皮肤活检发现他们的lENFD显著减少，说明在糖耐量异常时就有可能存在小神经纤维病变。 Smith等发现具有糖耐量异常或早期糖尿病性神经病的患者，主要表现为小纤维的异常，而神经传导速度主要测量的是大纤维的功能，因此IENFD是糖尿病或糖耐量异常患者测量轴突损伤的有力工具。 ( 4 参考文献 ) ( Koskinen M Hietaharju A K ylan jmiM et a l A quantjtativem ethod f o r the assessm ent of i n traepidemmal nerve f ibers in small f iber neuropathyJNeurol 2005 252(7)：789-94 ) ( 2 Swart ing C NaverH P i hlLundin ，I e t al Sweat gjand mopho logy andperjglandular i n ne ivatjon i n essentjal pa mar hype th idrosis before and after tream entwith intrademal botulinum toxin[ JJ Am Acad Dematol 2004； 51(5)： 7 39-45. ) ( in ipajred gjucose t o lemance a nd d i abetes assocjated n euiopathy〔 J Neurology200157(9)：1701-4 ) ( 4 Laurja G S kin Biopsy i n t h e D iagnosis ofPerPheia1Neuropa th ies[ J PractNeuiol2005 5 92-9. ) ( 5 WendelschafeCaabbG KennedyWR Wak D MorPhological fea tures of neives jn skin biopsjes[ J.JNeuro1Sgi 2006 242(1-2)15-21. ) ( 6 Laurja G Comblath DR Johansson Qe t al EFNS guidelines on t he useof sk in bjopsy i n the diaghosjs of pe r i Phem a ] neuipathy[ D. 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Neurojgy 2003 60(1)： 108- 1 1 . ) ( L2010-10-20收高 2010-11-06修回J ) ( 编辑 袁左鸣) ) 直肠癌NRP-1、、VEGF-C的表达与直肠系膜淋巴结转移的关系 黎 明 彭 勃 议谈 顺 谢 权 张 罡 (中南大学湘雅医学院附属海口医院普通外科，海南 海口 570208) 摘 要 目的 探讨观察神经纤毛蛋白-1(NRP-1)、血管内皮生长因子 -C(VEGF-C)在直肠癌组织中的表达与直肠系膜淋巴结转移的关系。方法 采用免疫组织化学 SP法检测40例直肠癌组织织 NRP-1VEGF-C的表达，结合其肿瘤生物学特性及直肠系膜淋巴结转移情况进行分析。结果 (1)直肠癌组织中NRP-1、VEGF-C的高表达率分别为67.5%、62.5%；(2)NRP-1 VEGF-C在直肠癌组织中的表达与直肠系膜淋巴结转移及肿瘤的分期相关，与性别、年龄、肿瘤大小、术前 CEA水平、侵犯肠管周径、浸润深度、分化程度不相关；(3)NRP1表达与 VEGF-C表达呈正相关(0.345 R0.05)，表达一致率为70.0%，两者均为高表达的患者直肠系膜淋巴结转移阳性率(70.0%)远高于两者均为低表达者(12.5%)(R0.05)。结论 NRP-1、VEGF-C在人直肠癌中共同表达，其过度表达与淋巴管增生和扩张、促进癌细胞的淋巴转移有关。 关键词」 直肠癌；神经纤毛蛋白-1；血管内皮生长因子-G直肠系膜；淋巴结转移 中图分类号JR735.3 文献标识码A 文章编号J1005-9202(2010)24-3659-04 神经纤毛蛋白( neuropilin NRP)是血管内皮生长因子(VEGF)受体之一，主要与有VEGF-A VEGF-B胎盘生长因子( Placental growth facor PLGF)、VEGF-E结合，增强 VEGFR-2的活性，促进内皮细胞的增殖和迁徙.已有相关报道证实，NRP-1在结直肠癌中呈高水平表达，与肿瘤的淋巴结转移相关‘。但尚未有 NRP-1与直肠系膜淋巴结转移相关性的报道。VEGF-C是 VEGF家庭中的一员，它与 VEGFR-2和 VEGFR-3结合促进内皮细胞增殖及肿瘤新生淋巴管的形成。 已有相关研究表明，VEGF-C能诱导淋巴管和血管的生成，促进结直肠癌的淋巴结转移，与淋巴结转移相关关。。但 VEGF-C与直肠系膜淋 ( 通讯作者：彭 勃(1958-)，男，教授，硕士生导师，主要从事胃肠道肿瘤研究。 ) 巴结转移的相关性及直肠癌中 VEGF-C与 NRP-1表达的关系尚未见报道。本研究观察 NRP-1、VEGF-C直直肠癌组织中的表达情况，了解两者表达的关系及其与直肠系膜淋巴结转移等临床病理因素的关系，以及对直肠癌发生、发展的作用。 材料与方法 1.1 临床资料 收集海口市人民医院2006年1月至2009年10月间手术切除直肠癌组织的存档蜡块40例。所有病例均以全直肠系膜切除(TME)原则行直肠癌根治术，术后标本按中央组(肠系膜下动脉根部淋巴结)中间组(直肠上动脉、乙状结肠动脉旁淋巴结)边缘组(上段直肠、乙状结肠边缘血管旁的淋巴结)、直肠系膜组(中下段直肠后方及两侧的淋巴结)进行淋巴结分组。所有病例术前未接受放、化疗。其中男26例，女14例。平均年龄60岁(29~84岁)组织学类型均为腺癌。 ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All fightsreserved. http：//www.cnki.ne 第作者：黎門(.硕击从事胃肠道瘤研究c Publishing例s均年龄ghts reserved. /WV .cnk.nei