水产品中孔雀石绿检测方案

LC5500高效液相色谱仪测定水产品中孔雀石绿 袁彦华 邱庆正 （北京东西分析仪器有限公司，北京 100094） 前言 孔雀石绿（MG）为三苯甲烷类工业染料, 在水产养殖上可以有效的预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病。并常用于鱼苗的消毒。但一些水产品贩运商为保持水产品新鲜度普遍用MG消毒车厢和活鱼池；酒店为了延长鱼的存活时间也在鱼池中投放MG进行消毒。使用MG消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。MG在水生生物体中的主要代谢产物为无色孔雀石绿（LMG）。MG具有毒性强、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用。LMG由于不溶于水，其残留毒性比MG更强。所以，目前世界上诸如美国、日本、加拿大和欧盟等许多国家已将MG列为水产养殖禁用药物，我国也于2002年5月将其列入“食品动物禁用的兽药及其化合物清单”（1）。虽然MG已被列为水产养殖禁用药物，但因为其价格低廉，同时目前在水霉病防治上尚无其它有效药品，因此仍有一些水产养殖户在普遍使用。 各类水产品中MG和LMG的检测是我国食品卫生学面临的新课题。为此，我国农业部2004年颁布了水产品中MG残留量测定的行业标准检验法-液相色谱法（SC/T3021-2004）（2）；国家质量监督检疫总局和国家标准化管理委员会于2005年亦发布了“液相色谱-串联质谱法”和“高效液相色谱法”（（GB/T19857-2005）（3）的标准检验法。Chang-Jun Cha等报道了（2001）采用氰基柱的反相高效液相色谱法和液质联机检测MG（4）。 在上述分析方法中，SC/T3021-2004采用C18柱，等梯度洗脱方式，但需要较大流速（2ml/min）；而 GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脱方式。文献（4）采用氰基柱分离的梯度洗脱方式。我们在研究这些分析方法的基础上，采用氰基柱分离、流速为1.0mL/min的等梯度洗脱方式，具有保留时间短、分离效果好、分析速度快、节省试剂；最低检测浓度无LMG为0.02μg/mL，MG为0.05μg/mL。精密度高；特别是线性范围达0.1μg/mL～160.0μg/mL，远远大于 SC/T3021-2004线性范围（MG 0.01μg/m L～0.4μg/mL；LMG0.02μg/mL～0.40μg/mL）。而且，等梯度洗脱方式又扩大了液相色谱的应用范围。现将结果报告如下： 1. 材料与方法 1. 1材料 1.1.1试剂 乙睛 色谱纯，fishte ； 乙酸铵 ，hplc纯 ，DIKMA； 孔雀石绿（MG） sigma试剂； 无色孔雀石绿（LMG） sigma试剂。 0.125mol/L乙酸铵溶液 称取乙酸铵9.64 g，用纯水溶解并定容至1000mL。用0.45μm滤膜过滤。 MG标准储备液 准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100 mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。避光、冰箱冷冻层保存。 MG标准应用液 吸取1mg/mL孔雀石绿标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。 LMG标准储备液 准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。 LMG标准应用液 吸取1mg/mL无色孔雀石绿标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。 MG和LMG标准混合溶液 分别吸取MG和LMG标准储备液，用乙睛稀释成不同浓度的标准混合溶液。 1.1.2 仪器 LC5500高效液相色谱仪（北京东西电子技术研究所）。具UV-VIS、在线脱气机、高压泵、柱恒温箱、色谱工作站。 1.2 步骤 1.2.1 色谱条件 检测器 紫外-可见光检测器，波长618nm； 色谱柱 氰基柱，4.6mm×250mm，5μm； 流动相 乙睛-0.125mol/L乙酸铵（pH4.5）=（47+53）； 柱温 35℃； 进样量 20μL。 1.2.2 测定步骤 吸取MG和LMG标准混合溶液（5.0μg/mL）注入色谱仪，在上述色谱条件下，绘制色谱图。见图1。 图1. 5.0μg/mL孔雀石绿和无色孔雀石绿 标准混合溶液色谱图 2.结果与讨论 2.1流动相的选择 MG和LMG的HPLC法分离，无论是C18柱还是氰基柱，多采用乙睛和乙酸铵作流动相的反相体系（1～4）。其中乙酸铵浓度对MG和LMG的分离有很大影响。对于梯度洗脱方式多采用50mmol/L乙酸铵溶液（2、3），而等梯度洗脱方式乙酸铵溶液浓度较大（0.125mol/L）（1）。 2.2 流动相溶剂比例的影响 在上述色谱条件下，用1.0μg/mL MG和LMG标准混合溶液在不同比例（V/V）乙睛-0.125mol/L乙酸铵溶液中观察分离效果，结果表明，在乙睛-乙酸铵溶液（pH4.5）=47+53时分离效果好，灵敏度最高，所以选择该溶剂比为流动相为。见表1。 表1 流动相溶剂比例对LMG/MG分离的影响 ACN/0.125mol/L乙酸铵 LMG MG （V/V） TR（min） A TR（min） A ΔTR（min） 40/60 10.56 65364 15.06 94433 7.1 45/55 9.06 66962 13.14 111812 4.1 47/53 8.70 67011 11.21 11.5076 2.5 50/50 7.25 56335 8.51 99594 1.3 55/45 6.62 —— 7.08 —— 0.4 2.3最低检测浓度 在上述色谱条件下，以3S/N的响应信号为最低检测浓度，LMG的最低检测浓度为0.02μg/mL，MG的最低检测浓度为0.05μg/mL。均能满足试验要求。见图2。 由图可见，以取样量10.0g计，最低检测浓度LMG为2μg/kg，MG为5μg/kg。 图2 LMG和MG最低检测浓度 2.4 线性范围试验 在上述色谱条件下，LMG和MG线性关系均良好。LMG和MG线性范围为2μg/mL～160.0μg/mL，r ＞0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL～10.0μg/mL范围的校正曲线见图3；1.0μg/mL～160.0μg/mL范围的校正曲线见图4。 (a) (b) 图3 LMG（a）和MG（b）校正曲线1（0.2μg/mL～10.0μg/mL） （c） （d） 图4 LMG（c）和MG（d）校正曲线2（1.0μg/mL～160.0μg/mL） 2.5精密度试验 在上述色谱条件下，分别用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合标准溶液进行平行性测定。保留时间相对标准偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面积相对标准偏差小于5%。见表2。 表2 不同浓度LMG/MG混合标准溶液测定精密度试验 LMG/MG LMG MG （μg/mL） TR A TR A 1.0 9.13 94326 11.84 121590 9.11 91624 11.82 124395 9.15 86984 11.82 126714 9.10 94254 11.77 115168 9.07 90030 11.73 115915 9.12 88426 11.75 118041 X 9.11 90940 11.78 120303 S 0.02730 3023.7 0.04450 4695.3 RSD（%） 0.3 3.3 0.4 3.9 5.0 9.01 346190 11.75 586155 8.91 334347 11.60 554314 8.89 350486 11.57 566958 9.07 337691 11.78 586993 9.06 333978 11.80 569882 9.01 328756 11.66 577275 X 8.99 338575 11.69 573596 S 0.07196 8198.3 0.09709 12493.2 RSD（%） 0.8 2.4 0.8 2.2 10.0 8.97 653769 11.63 1117447 9.03 689863 11.70 1147167 9.04 693111 11.71 1140571 9.00 681749 11.65 1264160 9.01 678101 11.67 1123467 X 9.01 679318.6 11.68 1158562 S 0.0270 15504.7 0.02750 60263 RSD(%) 0.3 2.3 0.2 5.0 3样品测定 3.1 样品处理 3.2样品测定 3.2.1校正曲线的绘制 3.2.2样品测定 3.3 加标回收率测定 4结论 LMG和MG毒性强、具有很高的三致作用，其对水产品的人为污染应受到严重关切。 LC5500高效液相色谱仪测定水产品中LMG和MG，具有方法简便、分离效果好、分析速度快、节省试剂、精密度高、灵敏准确、线性范围宽等优点，适用于水产品中LMG和MG含量检测。 参考文献 1.中国农业信息网.htm 2005-11-02，农业部。 2.中华人民共和国农业行业标准.水产品中孔雀石绿残留量的测定——液相色谱法（SC/T3021-2004）， 3.中华人民共和国国家标准. 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定，GB/T19857-2004。 4.Chang-Jun Cha，Daniel R，Doerge，and Carl E. Cerniglia.Biotransformation of Malachite green by the FungusCunninghamella elegans，Applied and Environmental Microbiology，September 2001，p.4358-4360，Vol.67，No.9