鱼肉中孔雀石绿和结晶紫检测方案(液质联用仪)

采用安捷伦 Bond Elut PCX 固相萃取柱和Poroshell 120 色谱柱对鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫进行LC/MS/MS分析 应用报告 食品测试与农业 作者 摘 要 Andy Zhai 安捷伦科技有限公司 本文建立并验证了一种同时测定鱼肉中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。采用固相萃取法对分析物进行提取，并采用液相色谱-正离子多反应监测模式的电喷雾离子化串联质谱法对其进行定量。该方法对鱼肉中所有化合物的定量限均为0.5 ng/g。这些化合物的动态校正范围为 0.5~100 ng/g。回收率介于96%~109%之间， RSD 值介于 1.7%~4.5%。 前言 孔雀石绿(MG)和结晶紫(CV)是主要用于染色的人工合成色素。此外，由于它们具有抗菌性，所以被用来治疗水生生物的传染性疾病，特别是鱼和鳗鱼。然而， MG 是一种疑似致癌物质，目前在水产养殖中被禁止使用[1]. Agilent Technologies 本文采用安捷伦 Bond Elut Plexa PCX固相萃取(SPE) 柱对鱼肉中的孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV) 及其代谢物隐色孔雀石绿(LMG) 和隐色结晶紫(LCV)进行提取，并对其进行 LC/MS/MS分析。表1列出了这4种化合物的名称和化学结构。 实验部分 试剂及化学品 所有试剂均为 MS、HPLC或者分析级。甲醇、乙腈和水购自Honeywell 公司。标准品和化学品购自北京百灵威科技有限公司。同位素标记的孔雀石绿(MG-d5)和同位素标记的隐色孔雀石绿(LMG-d6) 作为内标购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH 司司。鱼(鲫鱼)从当地的超市购买。 分别用甲醇配制各标准溶液，其浓度均为1.0mg/mL， 于-20℃冰箱中储存。用乙腈/水(10：90)配制混合工作溶液(10pg/mL)，并于4°C储存。加标溶液每日以混合工作溶液用水稀释制得。 分别用甲醇配制各内标溶液， 并于-20°℃冰箱中储存。使用前将各内标溶液混合并用甲醇稀释浓度至100 ng/mL。 TMPD溶液：用甲醇溶解50 mg N，N，N，N-四甲基-1，4-对苯二安二盐酸盐(TMPD)并定容至50mL。 Mcllvaine 缓冲液：取445.5mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液与54.5 mL 0.2 mol/L 的磷酸氢二钠溶液，混合即得。 洗脱缓冲液：取50mL 5 mol/L的酸酸铵溶液(调节pH 直至7.0)、100mL乙酸乙酯和350 mL甲醇， 混合即得。 表1.本文所用化合物 化合物 CAS 号 结 构 孔雀石绿 隐色孔雀石绿 结晶紫 隐色结晶紫 设备与材料 Agilent 1200 HPLC 系统 Agilent 6460三重四极杆 LC/MS/MS系统 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱，60mg， 3mL (部件号12108603) Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，窄径， 2.1×50 mm， 2.7 pm(部件牛699775-902) Agilent Vac Elut 20真空多管装置(部件号12234101) 样品制备 样品前处理 将鱼肉切成小块，用匀浆器匀化。称取1g匀浆样品，置于离心管中。加入 50 pL TMPD 溶液和 10 mL Mcllvaine 缓冲液/乙腈(1：1，v/v) 混合溶液。涡旋 1 min， 4500 rpm 离心5 min， 将上清液转移至干净的试管中。在离心管中继续加入 5 mL Mcllvaine 缓冲液/乙乙(1：1，v/v)混合溶液， 涡旋 1 min， 4500 rpm 离心5 min， 取上清液。合并两次上清液，即得用于SPE 的样品溶液。 固相萃取 SPE 操作过程如图1所示。先用2mL甲醇活化安捷伦 Bond ElutPlexa PCX 固相萃取柱，再用2mL2%甲酸(FA)水溶液平衡萃取柱。将样品溶液加载到萃取柱上，并在重力的作用下以大约1 mL/min 的流速通过萃取柱。萃取柱依依用 2mL 2% FA水溶液、2 mL 甲醇和 2 mL正己烷进行淋洗。真空干燥萃取柱 3 min后树脂吸附剂将干燥完全。用4mL洗脱缓冲液以 1 mL/min 的流速洗脱化合物。将洗脱液加水至5mL， 涡旋 10秒。将样品转移至 2mL色谱小样品瓶中用于分析。 图1.提取鱼肉样品中抗菌剂的固相萃取过程 仪器条件 梯度程序： 时间(min) %B 0 305 806 806.5 307 30 MS条件 采用正离子模式监测标准品及内标化合物。离子源条件详见表2，MRM transitions 见表3. 表 2. MS 离子源参数 干燥气温度： 300 °C 干燥气流量： 5 L/min 表3.多反应监测模式监测的离子对 HPLC条件被分析物 MRM转换通道(m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(V)色谱柱：安捷伦 Poroshell 120 EC-C18，MG 1) 329.3>313.3 175 382.1 ×50 mm， 2.7 pm2) 329.3>208.3 38(部件号699775-902)CV 1) 372.3>356.2 175 42流动相：A：水(5mM乙酸铵溶液)2)372.3>251.1 36B： 乙腈 (0.1% FA溶液)LMG 1)331.3>316.2 175 262) 331.3>238.2 16进样量：5 pLLCV 1)374.3>358.3 175 30流速：0.4 mL/min2) 374.3>238.2 26MG-d5 334.3>318.3 175 38柱温：室温LMG-d6 337.3>240.2 175 30 结果与讨论 线性和检测限 所有被测农药校准曲线的线性范围为 0.5~100 ng/g。分别向空白基质中添加标准品使浓度为0.5、1、5、10和100ng/g， 得校准曲线线性范围；内标浓度为 10 ng/g。 经过了整个样品制备过程处理的鱼肉作为空白基质。校准曲线由分析物的相对响应值(分析物与内标的峰面积比)与相对浓度(被分析物与内标的浓度比)绘制而成。针对所有化合物建立的定量限 LOQ (0.5 ng/g)，低于水产品中这些物质的 MRL。表4展示了线性回归方程和相关系数(R2)[2]。 表4.抗菌剂的线性 雾化器压力： 45 psi 鞘气温度： 400°C 化合物 内标 回归方程 R2 鞘气流量： 11L/min MG MG-d5 Y=0.0961x+0.0049 喷嘴电压： 正极：0V负极：0V CV MG-d5 Y=0.2808x-0.0524 0.999 毛细管电压： 正极：3500V负极：3500V LMG LMG-d6 Y=0.0649x+0.0033 LCV LMG-d6 Y=0.05461x-0.0011 回收率和重现性 表5.鱼肉中抗菌剂的回收率和重现性 在三个浓度水平下进行了回收率和重现性实验；向鱼肉中添加标准品使浓度为1、10和50 ng/g。 每个水平重复进样6次。回收率和重现性数据详见表5。图2为加标浓度为 10 ng/g 的鱼肉提取物的色谱图。 MG 1 102.1 3.5 10 102.8 1.8 50 99.2 1.9 CV 1 96.9 2.1 10 102.8 2.6 50 97.4 1.7 LMG 1 103.5 2.6 10 108.9 3.4 50 96.7 3.7 LCV 1 99.4 3.8 10 106.1 3.8 50 102.7 4.5 ×10?+MRM (329.3->313.3) 采集时间(min) 图 2.采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱分析鱼肉中抗菌剂加标浓度为 10 ng/g 时的色谱图 结论 本文建立了同时测定孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。研究表明安捷伦 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱可以有效地纯化和富集水产品如鱼中的染料。基于空白加标测定所得的回收率和重现性能满足鱼中染料残留检测相关标准的要求。本方法将杂质与基质效应最小化，对目标化合物的定量分析未产生干扰。 ( 参考文献 ) ( 1. Kazuyuki Yamashita. LC-MS/MS An a lysis of Ma l achiteGreen and Crystal Violet using Pursuit XRs ( 采 用 Pursuit XRs 和 LC-MS/MS 分析孔雀石绿和结晶紫)。应用报告，安捷伦科 技有限公司，出版号 SI-01313。 (2008) ) ( 2. GB/T 19857-2005。水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定。中 国 标准。www. c n-standard.net。 ) 更多信息 这些数据代表了典型的结果。如需了解有关我们产品和服务的更多信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标等如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年3月12日，中国印刷 5991-0091CHCN Agilent Technologies 摘要本文建立并验证了一种同时测定鱼肉中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。采用固相萃取法对分析物进行提取，并采用液相色谱-正离子多反应监测模式的电喷雾离子化串联质谱法对其进行定量。该方法对鱼肉中所有化合物的定量限均为0.5 ng/g。这些化合物的动态校正范围为0.5~100 ng/g。回收率介于 96%~109% 之间，RSD 值介于1.7%~4.5%。前言孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）是主要用于染色的人工合成色素。此外，由于它们具有抗菌性，所以被用来治疗水生生物的传染性疾病，特别是鱼和鳗鱼。然而，MG 是一种疑似致癌物质，目前在水产养殖中被禁止使用。本文采用安捷伦Bond Elut Plexa PCX 固相萃取（SPE）柱对鱼肉中的孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）及其代谢物隐色孔雀石绿（LMG）和隐色结晶紫（LCV）进行提取，并对其进行LC/MS/MS 分析。表1 列出了这4 种化合物的名称和化学结构。结论本文建立了同时测定孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。研究表明安捷伦Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱可以有效地纯化和富集水产品如鱼中的染料。基于空白加标测定所得的回收率和重现性能满足鱼中染料残留检测相关标准的要求。本方法将杂质与基质效应最小化，对目标化合物的定量分析未产生干扰。