LC-MS/MS检测鱼肉中的27种性激素残留

依据国家标准《GB 31656.14-2022 食品安全国家标准 水产品中27 种性激素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，建立了使用岛津三重四极杆液质联用仪测定鱼肉中性激素残留的方法。27种性激素在2 μg/L~100 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数r在0.999以上。在2、20和100 μg/L三个浓度下，连续六针进样，化合物的保留时间和峰面积的RSD%分别在0.03%~0.32%和0.33%~9.85%之间，仪器精密度良好。加标浓度为2和50 μg/kg的样品，85%以上的化合物回收率在60%~120%之间且重复性良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于水产品中性激素残留量的准确检测。SSL-CA23-229 Excellence in ScienceLCMSMS-794 LC-MS/MS 检测鱼肉中的27种性激素残留 LCMSMS-794 摘要：本文建立了使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用测定鱼肉中27种性激素残留量的方法。性 激素在 2.0 ug/L~100.0 ug/L浓度范围内线性良好，相关系数r在0.997以上。在高、中、低三个浓度下，化 合物的保留时间和峰面积的 RSD% 分别在 0.03%~0.32%和0.33%~9.85%之间，仪器精密度良好。加标浓度 为2和50 ug/kg 的样品，85%以上的化合物回收率在 60%~120%之间且重复性良好。该方法灵敏度高，分 析时间短，结果准确，可用于水产品中性激素残留量的准确定量检测。 关键词：：三重四极杆液质联用仪鱼肉 性激素 技术特点： *一针法可同时分析水产品中的雌激素、孕激素和雄激素 心使用自动进样器的同时注入预处理功能配制基质匹配标准曲线。 性激素是性腺分泌的一类甾体激素，包括雌激素、孕激素和雄激素，激素类药物可促进动物生长、有利 于蛋白质的积淀、增加产量。水产品饲养中使用促进 其生长的性激素行为已经成为全球性的食品安全问题，长期使用添加性激素的水产品会造成内分泌失调、肝 功能紊乱、胆结石等，甚至有致癌的风险。《中华人 民共和国农业农村部公告第250号》已将己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、、甲基睾酮、群勃龙等激素列入 食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。 为了保障人们的食品安全，农业农村部首次发布 了《GB 31656.14-2022 食品安全国家标准水产品中 27种性激素残留量的测定》。样品中残留的性激素用 乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提 取，提取液经浓缩、C18固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。本文参考标准，建立 了鱼肉中27性激素的检测方法，该方法快速、简单、灵敏，可实现对水产品中27种性激素的有效检测。 1.1仪器 本实验采用岛津Nexera LC-40 X3与三重四极杆质谱仪LCMS-8045 联用系统。具体配置为： 系统控制器SCL-40自动进样器：SIL-40C X3输液泵LC-40B质 谱 仪义：LCMS-8045柱温箱CTO-40S色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.114 在线脱气机： DGU-405 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Scepter C18-120 (100 mm×.2.1 mm l.D， 1.9 um)岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-31012-05 流动相 ：A相-0.02%氨水，B相-甲醇 柱 流 温： 30℃ 速 0.3 mL/min 进样体积只：：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，，初始浓度为B相55%，时间程序见表1 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 85 6.10 Pumps Pump B Conc. 97 8.20 Pumps Pump B Conc. 97 8.21 Pumps Pump B Conc. 55 12.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI， 正负离子模式 接口电压：1.0kV DL 管温度：200℃加热模块温度：450°℃ 雾化气：氮气 3.0 L/min 干燥气：氮气 10 L/min 接口温度：350℃ 扫描模模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10L/min MRM参参数：见表2 碰撞童气：氩气(230kPa) 表2 MRM 参数 No. 中文名称 英文名称 内标物 分子式 CAS NO. 分子量 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 1 己二烯雌酚 Dienestrol 己烯雌酚-D。 C18H182 84-17-3 266.3 265.1 236.1*249.1 10.019.0 18.023.0 24.028.0 2 己烯雌酚 Diethylstilbestrol C182002 56-53-1 268.4 267.1 237.1* 251.1 18.0 15.0 28.0 25.0 25.0 27.0 雌酮-D， 134.1* 18.0 14.0 13.0 3 己烷雌酚 Hexestrol C18H20 84-16-2 270.4 269.1 119.1 18.0 37.0 22.0 145.1* 16.0 38.0 27.0 4 雌酮 Estrone C18H2202 53-16-7 270.4 269.1 159.2 16.0 34.0 18.0 183.2* 20.0 42.0 19.0 5 雌二醇 B-Estradiol C182402 50-28-2 272.4 271.2 145.1 19.0 43.0 26.0 145.1* 20.0 43.0 25.0 6 雌三醇 Estriol 雌二醇-13C， C18H2493 50-27-1 288.4 287.2 171.1 20.0 37.0 17.0 159.1* 19.0 38.0 29.0 7 炔雌醇 Ethinyl Estradiol C20H2492 57-63-6 296.4 295.2 145.1 19.0 42.0 27.0 8 苯甲酸雌二醇 B-Estradiol3-benzoate C25H2893 50-50-0 276.5 377.2 135.1*105.1 -27.0-14.0 -16.0-21.0 -25.0-18.0 9 17-a羟基孕酮 17A-acetoxyproges- terone 甲羟孕酮-D， C233204 302-23-8 372.5 373.2 109.1* -14.0 -33.0 -19.0 97.1 -25.0 -28.0 -18.0 10 21-a羟基孕酮 Desoxycorticoste-rone C21H3093 64-85-7 330.5 331.2 109.1*97.1 -23.0 -12.0 -26.0 -25.0 -20.0 -18.0 LCMSMS-794 123.1* -14.0 -29.0 -21.0 11 醋酸甲羟孕酮 Medroxyprogester- one Acetate C24H3404 71-58-9 386.5 387.3 327.3 -14.0 -13.0 -22.0 Chlormadinone 309.3* -15.0 -16.0 -21.0 12 醋酸氯地孕酮 Acetate C23H29CIO4 302-22-7 404.9 405.2 301.2 -11.0 -22.0 -20.0 267.2* -14.0 -19.0 -18.0 13 醋酸甲地孕酮 Megestrol Acetate 甲羟孕酮-D， C24H3204 51154-23-5 384.5 385.3 224.2 -14.0 -26.0 -23.0 109.1* -11.0 -27.0 -18.0 14 左炔诺孕酮 Levonorgestre C21H282 797-63-7 312.5 313.2 245.2 -12.0 -18.0 -27.0 15 甲羟孕酮 Medroxyprogester-one C223293 520-85-4 344.5 345.3 97.1*123.1 -13.0-13.0 -24.0-24.0 -17.0-22.0 257.2* -20.0 -16.0 -17.0 16 诺龙 Nandrolone C182602 434-22-0 274.4 275.2 239.2 -20.0 -16.0 -25.0 17 苯丙酸诺龙 Nandrolone phenyl-propionate 甲基睾酮-D， C27H3403 62-90-8 406.6 407.2 257.2* 105.2 -15.0 -15.0 -17.0 -28.0 -17.0 -19.0 97.2* -21.0 -23.0 -18.0 18 睾酮 lestosterone C19282 58-22-0 288.4 289.2 109.1 -10.0 -26.0 -19.0 121.1* -10.0 -22.0 -21.0 19 勃地酮 Boldenone C19H2602 846-48-0 286.4 287.2 135.2 -10.0 -15.0 -13.0 20 孕酮 Progesterone 孕酮-D。 C21H302 57-83-0 314.5 315.2 109.1*97.1 -12.0-11.0 -24.0-23.0 -21.0-17.0 199.1* -19.0 -23.0 -20.0 21 群勃龙 Trenbolone 甲基睾酮-D， C182202 10161-33-8 270.4 271.2 253.2 -19.0 -20.0 -17.0 22 甲基睾酮 17-Methyltestoster-one C20H309 58-18-4 302.5 303.2 109.1*97.1 -12.0-11.0 -28.0-25.0 -20.0-17.0 109.1* -20.0 -25.0 -19.0 23 雄烯二酮 Androstenedione 甲基睾酮-D， C19H2692 63-05-8 286.4 287.2 97.1 -10.0 -24.0 -18.0 24 美雄酮 Methandrosteno-tone C20H282 72-63-9 300.4 301.2 149.2* 121.1 -12.0-12.0 -15.0 -26.0 -28.0-21.0 231.2* -20.0 -19.0 -15.0 25 炔诺酮 Norethindrone 甲羟孕酮-D， C20H2602 68-22-4 298.4 299.2 109.1 -11.0 -28.0 -19.0 26 康力龙 Stanozolol C21H32NO 10418-03-8 328.5 329.3 121.1* 81.1 -12.0 -12.0 -39.0 -50.0 -21.0 -29.0 27 丙酸睾酮 Testosterone propi- onate 甲基睾酮-D， C223293 57-85-2 344.5 345.3 97.1* 109.1 -13.0 -13.0 -23.0 -30.0 -17.0 -19.0 28 己烯雌酚-D。8 Diethylstilbestrol-d， C18H12D0 91318-10-4 276.4 275.2 259.4* 19.0 26.0 17.0 29 此酮-D， Estrone-d. CHD，O， 56588-58-0 272.4 271.2 145.1* 19.0 40.0 27.0 30 雌二醇-13C， Estradiol-13C. 15C，C1HO 82938-05-4 274.4 273.2 147.1* 19.0 41.0 28.0 LCMSMS-794 31 甲羟孕酮-D， Medroxyprogester- one-d. C24H31D504 162462-69-3 347.5 348.3 126.2* -13.0 -27.0 -22.0 32 孕酮-D。 Progesterone-d。 CHDO， 15775-74-3 323.5 324.3 100.2* -12.0 -23.0 -18.0 33 左炔诺孕酮-D。 Levonorgestrel-d， C21H222602 一 318.5 319.3 251.2* -11.0 -18.0 -27.0 34 甲基睾酮-D， Methyltestoster-one-d. C20H27D0 96425-03-5 305.5 306.2 109.2* -11.0 -27.0 -20.0 *表示定量离子 样品前处理和标准溶液配制 2.1样品前处理 参考 《GB 31656.14-2022 食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中8.1和8.2样品提取与净化的方法。 2.2标准溶液配制 准确量取各标准储备液(100ug/mL)适量，用甲醇稀释成A组(己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟 基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮)浓度为1 ug/mL；B组(己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙)浓度为 2 ug/mL； C组(雌三醇和炔雌醇)浓度为4 ug/mL 的 混合标准中间液。 准确量取内标储备液(100 ug/mL)适量，用甲醇稀释配制浓度为 1 ug/mL的混合内标溶液。 结果与讨论 3.127种性激素标准溶液谱图 配制 2 ng/mL 的性激素混合标准溶液((以A组浓度计，内标浓度为 30 ng/mL)，上机分析，得到27种性 激素标准溶液的 MRM 色谱图，详见图1，色谱峰形良好，通道无干扰。 图1 2 ng/mL 27 种性激素标液的 MRM 色谱图(以A组计，内标浓度为30ng/mL) 3.2校准曲线和检出限 校准曲线分析采用自动进样器的同时注入预处理功能 (Co-injection)，进样时自动进样器先吸出5uL经前 处理的空白样品萃取液作为基质溶液，之后吸出等量5 uL的各浓度混合标准溶液(2、5、10、20、50和100ug/L)，同时注入两种溶液，供液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示(部分)。。27种性激素校准曲线及检测限、定量限的结果见表3。 图2 部分性激素的标准曲线 表327种性激素校准曲线及检测限、定量限 编号 化合物 校准曲线 相关系数R 准确度% 检测限 (ng/mL) 定量限 (ng/mL) 1 群勃龙 Y=(0.0286763)X+(0.0658957) 0.9992 75.8~115.8 0.02 0.06 2 勃地酮 Y=(0.0757929)X+(0.0792642) 0.9998 81.5~109.8 0.07 0.21 3 雄烯二酮 Y=(0.0581034)X+(0.116352) 0.9992 78.9~109.6 0.05 0.15 4 诺龙 Y=(0.0134754)X+(0.0125211) 0.9994 84.5~107.2 0.35 1.07 5 炔诺酮 Y=(0.0116608)X+(0.0199124) 0.9987 82.6~120.5 0.41 1.25 6 美雄酮 Y=(0.0757432)X+(0.215163) 0.9979 71.5~113.6 0.03 0.10 7 21-a羟基孕酮 Y=(0.0200874)X+(0.0676297) 0.9992 80.1~111.5 1.14 3.45 8 睾酮 Y=(0.0610936)X+(0.105638) 0.9990 80.2~110.2 0.06 0.17 9 左炔诺孕酮 Y=(0.0414320)X+(-0.0863241) 0.9995 90.6~111.0 0.93 2.83 10 17-a羟基孕酮 Y=(0.0146499)X+(0.0261651) 0.9998 79.0~112.5 0.14 0.43 11 甲基睾酮 Y=(0.0405162)X+(0.0665000) 0.9996 80.6~108.6 0.07 0.21 12 甲羟孕酮 Y=(0.0282523)X+(0.0231420) 0.9999 85.7~106.8 0.26 0.78 13 醋酸甲地孕酮 Y=(0.0197755)X+(0.00680865) 0.9998 88.9~112.8 0.09 0.28 14 醋酸氯地孕酮 Y=(0.0109172)X+(0.0108099) 0.9999 79.2~110.6 0.23 0.69 15 醋酸甲羟孕酮 Y=(0.0228917)X+(0.0140802) 0.9999 86.7~115.1 0.10 0.29 16 孕酮 Y=(0.0329618)X+(0.294889) 0.9997 72.3~103.7 0.62 1.87 17 康力龙 Y=(0.00787695)X+ (0.0499746) 0.9991 88.1~113.3 0.24 0.73 18 丙酸睾酮 Y=(0.0124907)X+ (0.00848029) 0.9999 91.7~109.0 1.07 3.23 19 苯甲酸诺龙 Y=(0.0718706)X+(-0.0108243) 0.9998 79.3~114.0 0.03 0.09 20 苯甲酸雌二醇 Y=(0.00318960)X+(-0.00164131) 0.9996 94.2~113.2 0.36 1.10 LCMSMS-794 21 雌三醇 Y=(0.0130318)X+(-0.161255) 0.9983 78.0~119.6 0.43 1.30 22 雌酮 Y=(0.0246571)X+(0.0355047) 0.9998 72.4~112.3 0.06 0.19 23 炔雌醇 Y=(0.00987936)X+ (0.0848164) 0.9998 79.3~116.3 0.21 0.65 24 雌二醇 Y=(0.0162429)X+(0.0666055) 0.9997 74.3~114.2 0.18 0.53 25 己烯雌酚 Y=(0.0644922)X+(-0.0526971) 0.9997 86.1~113.0 0.04 0.12 26 己二烯雌酚 Y=(0.0299950)X+(-0.0629520) 0.9998 84.3~125.5 0.15 0.47 27 己烷雌酚 Y=(0.112934)X+(0.211375) 0.9994 79.6~124.8 0.01 0.02 3.3重复性实验 取 2、20和100 ug/L标准品溶液，连续进样6次，考察仪器的重复性，测定结果见表4。 表427种性激素保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 编号 化合物 RSD% (2 ug/L) RSD% (20 ug/L) RSD% (100 ug/L) R.T Area R.T Area R.T Area 1 群勃龙 0.07 2.66 0.06 1.16 0.13 0.72 2 勃地酮 0.07 2.41 0.05 1.26 0.13 0.56 3 雄烯二酮 0.07 3.13 0.05 1.09 0.10 0.69 4 诺龙 0.08 4.22 0.05 2.16 0.09 1.09 5 炔诺酮 0.07 3.87 0.05 1.22 0.10 0.61 6 美雄酮 0.05 2.03 0.05 1.39 0.08 1.69 7 21-a羟基孕酮 0.06 2.84 0.05 1.78 0.09 0.33 8 睾酮 0.07 2.40 0.05 1.62 0.07 0.84 9 左炔诺孕酮 0.06 3.09 0.06 1.47 0.05 1.95 10 17-a羟基孕酮 0.05 4.86 0.05 1.96 0.06 1.16 11 甲基睾酮 0.06 3.59 0.05 0.81 1.04 12 甲羟孕酮 0.05 2.75 0.05 1.86 0.83 13 醋酸甲地孕酮 0.06 3.18 0.04 1.52 0.05 005 2.13 14 醋酸氯地孕酮 0.05 4.04 0.04 1.76 1.11 15 醋酸甲羟孕酮 0.05 1.84 0.05 1.67 1.52 16 孕酮 0.06 1.65 0.04 1.25 0.04 1.00 17 康力龙 0.03 1.67 0.04 1.23 0.03 1.00 18 丙酸睾酮 0.04 2.01 0.04 0.93 0.05 1.76 19 苯甲酸诺龙 0.03 0.85 0.04 2.22 0.04 0.95 20 苯甲酸雌二醇 0.03 2.79 0.05 1.18 0.03 1.29 21 雌三醇 0.15 3.37 0.08 1.06 0.32 1.85 22 雌酮 0.05 7.68 0.05 3.60 0.06 1.37 23 炔雌醇 0.09 8.75 0.07 2.69 0.06 1.11 24 雌二醇 0.08 3.32 0.06 2.74 0.05 2.05 25 己烯雌酚 0.10 5.73 0.05 3.40 0.05 2.47 26 己二烯雌酚 0.09 9.84 0.06 3.05 0.05 2.21 27 己烷雌酚 0.04 4.76 0.05 3.10 0.05 1.89 3.4加标回收率 取空白鱼肉5g，加入混标工作液，使加标浓度为2和50 ug/kg(以A组化合物计)，样品经提取及净化后，按照1.2中的分析条件测定各种性激素的加标回收率，实际样品分析同样采用自动进样器的同时注入预处理功能，吸取水：甲醇=15：85(v/v)溶液替代混合标准溶液，，平行测定3次。即使在2 ug/kg 的加标浓度下，85%以 上的化合物回收率在 60%~120%之间。具体加标回收率结果及相对标准偏差见图3所示。由结果可知，该方法 灵敏度高，准确率好，可以满足27种性激素的快速检测。 图3 性激素的加标回收率及相对标准偏差结果 结论 依据国家标准《GB 31656.14-2022 食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质 谱法》，建立了使用岛津三重四极杆液质联用仪测定鱼肉中性激素残留的方法。27种性激素在 2 ug/L~100 ug/L 浓度范围内线性良好，相关系数r在0.999以上。在2、20和100 ug/L三个浓度下，连续六针进样，化合物的 保留时间和峰面积的 RSD%分别在0.03%~0.32%和0.33%~9.85% 之间，仪器精密度良好。加标浓度为2和 50 ug/kg 的样品，85%以上的化合物回收率在 60%~120%之间且重复性良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于水产品中性激素残留量的准确检测。 岛津应用云