玉米粉和菊苣中蛋白质、脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的检测

体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷、氢气产量和挥发性脂肪酸组成的影响动物营养学报２０１９，３１（３）：１１９８⁃１２０９Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｄｏｉ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．０３．０２５ 王 荣等：体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷、氢气产量和挥发性脂肪酸组成的影响３期９９１１ 体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷 、氢气产量和 挥发性脂肪酸组成的影响 王 荣 １，２ 文江南 １，２∗ 王 敏 ２∗∗ 邓近平 １，３∗∗ 谭支良 ２ （１．湖南农业大学动物科学技术学院 ，长沙 ４１０１２８；２．中国科学院亚热带农业生态研究所 ，长沙 ４１０１２５；３．华南农业大学动物科学技术学院 ，广州 ５１０６４２） 摘 要 ：本试验旨在研究不同添加水平的延胡索酸对体外发酵甲烷 、氢气产量 、挥发性脂肪酸 组成以及微生物数量的影响 。选用 ３只装有永久性瘤胃瘘管的成年湘东黑山羊作为瘤胃液供 体 。试验采用 ２×４双因子试验设计 ，以发酵底物和延胡索酸作为影响因素 ，其中发酵底物分别 是菊苣和玉米粉 ，延胡索酸设定 ０、３、６和 １２ ｍｍｏｌ／Ｌ ４个添加水平 ，另外设空白组 ，即发酵瓶中 不添加发酵底物 ，仅添加 ０、３、６和 １２ ｍｍｏｌ／Ｌ 延胡索酸用来矫正数据 ，每组 ２个平行 ，重复测定 ３次 。采用全自动体外模拟瘤胃发酵设备 ，进行 ７２ ｈ 体外模拟瘤胃发酵试验 。结果表明 ：１）玉 米粉的 ７２ ｈ 产气量 、干物质消失率均显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５）。延胡索酸显著增加了 ７２ ｈ 产气 量 （Ｐ ＜０．０５），但对 ７２ ｈ 矫正产气量 （去除各个添加水平延胡索酸自身的产气量 ）、干物质消失率 无显著影响 （Ｐ ＞０．０５）。发酵底物和延胡索酸对 ７２ ｈ 产气量和干物质消化率不存在显著交互作 用 （Ｐ ＞０．０５）。 ２）玉米粉的氢气产量和矫正氢气产量只有在 １２ ｈ 显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５），而 ２种底物在其他时间点的氢气产量和矫正氢气产量无显著差异 （Ｐ ＞０．０５）；玉米粉不同时间点甲烷 产量和矫正甲烷产量均显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５）。延胡索酸对不同时间点甲烷产量 、矫正甲烷产 量和氢气产量 、氢气矫正产量均无显著影响 （Ｐ ＞０．０５）。延胡索酸和底物对不同时间点的氢气和 甲烷产量不存在显著交互作用 （Ｐ ＞０．０５）。 ３）延胡索酸显著增加了乙酸 、丙酸和总挥发性脂肪 酸浓度 （Ｐ ＜０．０５），显著降低了乙丙比和 ｐＨ （Ｐ ＜０．０５）。但是 ，延胡索酸对矫正总挥发性脂肪酸 浓度没有显著影响 （Ｐ ＞０．０５）。 ４）延胡索酸对微生物数量均没有显著影响 （Ｐ ＞０．０５）。结果提 示 ，和菊苣相比 ，玉米粉富含更多易发酵碳水化合物 ，这有助于产生更多的气体和挥发性脂肪 酸 。延胡索酸可以增加体外产气量和挥发性脂肪酸浓度主要因为延胡索酸在发酵过程中自身 可以代谢产生额外的气体和挥发性脂肪酸 ，这会使产气量和挥发性脂肪酸浓度增加 ，而对于发 酵底物自身的降解和微生物数量没有显著影响 。 关键词 ：延胡索酸 ；体外模拟瘤胃发酵 ；发酵类型 ；氢气产量 ；挥发性脂肪酸 中图分类号 ：Ｓ８１６ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１００６⁃２６７Ｘ （２０１９）０３⁃１１９８⁃１２ 延胡索酸是三羧酸循环中重要的中间代谢产 基作用转变成丙酸 ，同时伴随着氢的消耗 物 ［１－４］，在瘤胃中首先被还原成琥珀酸 ，经过脱羧 ［Ｃ４Ｈ４Ｏ４＋２Ｈ →Ｃ３Ｈ６Ｏ２＋ＣＯ２］［２，５－６］。当氢被用于 收稿日期 ：２０１８－０８－１７ 基金项目 ：国家科技计划项目 （２０１８ＹＦＤ０５０１８００，２０１６ＹＦＤ０５００５４）；国家自然科学基金项目 （ ３１５６１１４３００９，３１４７２１３３）；湖南省重大专项 （２０１７ＮＫ１０２０）；中国科学院青年促进会项目 （２０１６３２７）；中国科学院特聘研究员项目 （２０１８ＶＢＡ００３１） 作者简介 ：王 荣 （１９９０—），男 ，河南淮阳人 ，博士研究生 ，从事反刍动物营养与饲料科学研究 。 Ｅ⁃ｍａｉｌ ：ｗａｎｇｒｏｎｇｆｄ＠１２６．ｃｏｍ ∗同等贡献作者 ∗∗通信作者 ：王 敏 ，副研究员 ，Ｅ⁃ｍａｉｌ ：ｗｉｎｇ ｍａｉｌ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ ；邓近平 ，研究员 ，博士生导师 ，Ｅ⁃ｍａｉｌ ： ｄｅｎｇｊｉｎｐｉｎｇ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 还原延胡索酸时 ，甲烷菌可利用氢将减少 。因此 ，延胡索酸可以作为电子受体 ，通过琥珀酸 －丙酸代 谢通路和增加延胡索酸利用菌的数量与甲烷菌竞 争氢 ，减少甲烷产生 ［３，７－８］。另外 ，延胡索酸进入瘤 胃后还能代谢产生乙酸 ［５］。当 １ ｍｏｌ 延胡索酸被 代谢成乙酸时 ，会伴随着 ４ ｍｏｌ 还原当量的产生 ［Ｃ４ Ｈ ４ Ｏ ４ ＋ ２ Ｈ ２Ｏ →Ｃ２Ｈ４Ｏ２＋２ＣＯ２＋４Ｈ ］［５］。这 ２种不同的延胡索酸代谢通路可能导致瘤胃氢气 、甲烷和挥发性脂肪酸不同的生成模式 。 许多研究结果表明 ，延胡索酸可以增加丙酸 和总挥发性脂肪酸浓度 ［９－１２］。但是 ，延胡索酸是 通过自身代谢额外增加挥发性脂肪酸 ，还是通过 改变底物发酵模式 ，目前还不是很清楚 。本试验 通过研究延胡索酸的代谢产物 （氢气 、甲烷和挥发 性脂肪酸等 ），揭示不同添加水平延胡索酸对瘤胃 氢气 、甲烷和挥发性脂肪酸生成模式的影响机制 。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 体外发酵底物 本试验选择营养水平差异较大的玉米粉和菊 苣分别作为不同类型的发酵底物 ，这 ２种饲料原 料均来自于中国科学院环江喀斯特农业生态系统 观测研究站 。玉米采用 “按比例分层抽样法 ”取样 ３００ ｇ 带回实验室 ，在鼓风干燥烘箱内 ６５ ℃烘 ２４ ｈ ，然后用微型植物粉碎机粉碎后过 １．０ ｍｍ 筛 。菊苣采用 “齐地面刈割法 ”取样 ３００ ｇ 带回实 验室 ，在鼓风干燥烘箱内 ９５ ℃杀青 ０．５ ｈ ，然后 ６５ ℃烘 ２４ ｈ ，粉碎后过 １．０ ｍｍ 筛 。 按照饲料常规养分测定的方法 ，对饲料样品 中的干物质 （ＤＭ ）、粗蛋白质 （ＣＰ ）、粗灰分 （Ａｓｈ ）、粗脂肪 （ＥＥ ）、无氮浸出物 （ＮＦＥ ）、中性洗 涤纤维 （ＮＤＦ ）和酸性洗涤纤维 （ＡＤＦ ）含量进行测 定 ［１３］，测定结果见表 １。 １．１．２ 人工瘤胃培养液 选择 ３只装有永久性瘤胃瘘管的湘东黑山羊 作为瘤胃液供体动物 。试验山羊每天饲喂稻草 ４００ ｇ 和精料 ６００ ｇ ，每天 ０８：００和 １８：００分 ２次等 量饲喂 ，自由饮水 。试验当天 ，在晨饲前 １ ｈ ，随机 从 ２只瘘管羊取得新鲜瘤胃液 ，迅速装入保温瓶 带回实验室 。人工瘤胃营养液的配制参照 Ｍｅｎｋｅ 等 ［１４］的方法 。将采集的瘤胃液用 ６层脱脂纱布过 滤 ，量取 ６００ ｍＬ 的瘤胃液迅速加入到准备好的 ２ ４００ ｍＬ 人工瘤胃营养液中 （瘤胃液与人工瘤胃 营养液体积比为 １∶４），制成混合人工瘤胃培养液 ，整个过程的温度保持在 ３９．５ ℃，通入纯二氧化碳 以保持厌氧环境 （以刃天青变成无色来判断 ）。磁 力搅拌器搅拌人工瘤胃培养液 ，以保持瘤胃液与 营养液混合均匀 。 表 １ 饲料原料的营养水平 （干物质基础 ） Ｔａｂｌｅ １ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ （ＤＭ ｂａｓｉｓ ） ％ 项目 玉米粉 菊苣 Ｉｔｅｍｓ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ Ｃｈｉｃｏｒｙ 干物质 ＤＭ ８７０ ８８３ 粗蛋白质 ＣＰ ７８ １２６ 粗灰分 Ａｓｈ ２３ １００ 粗脂肪 ＥＥ ５４ ４４ 无氮浸出物 ＮＦＥ ８３２ ４１１ 中性洗涤纤维 ＮＤＦ １８８ ６８０ 酸性洗涤纤维 ＡＤＦ ２３ ４１５ １．１．３ 延胡索酸 本试验使用的延胡索酸从 Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ 公司 购买 ，纯度 ≥９９．０％。 １．１．４ 全自动体外模拟发酵设备 本研究采用的全自动体外瘤胃发酵设备 ，包 括厌氧瓶 、三通电磁阀 、培养箱 、压力传感器 、计算 机和气相色谱仪 ［１５］。培养箱设定 ：振荡频率 ５０ ｒ ／ｍｉｎ 和培养温度 ３９．５ ℃。厌氧瓶通过导管与 三通电磁阀和压力传感器连接 。压力传感器与计 算机连接 ，每分钟测定并记录瓶中压力 ，通过压力 与气体体积间关系计算气体生成量 。三通电磁阀 受计算机控制 ，当厌氧瓶中压力超过 ９ ｋＰａ ，电磁 阀自动打开 ，厌氧瓶气体释放 ，并通过导管进入气 相色谱仪 （安捷伦 ７８９０Ａ ，美国 ）测定排出气体中 的氢气和甲烷含量 。氢气 （甲烷 ）产量根据厌氧瓶 顶部空间大小 、压力与气体体积的转化系数进行 计算 ［１６］。 １．２ 试验方法 １．２．１ 试验设计 试验采用 ２×４双因子试验设计 ，以发酵底物 和延胡索酸作为影响因素 ，其中发酵底物分别是 菊苣和玉米粉 ，延胡索酸设定 ０、３、６和 １２ ｍｍｏｌ／Ｌ ４个添加水平 ，另外设空白组 ，即发酵瓶中不添加 发酵底物 ，仅添加 ０、３、６和 １２ ｍｍｏｌ／Ｌ 延胡索酸 用于矫正数据 ，每组 ２个平行 ，重复测定 ３次 。 １．２．２ 体外瘤胃发酵试验操作 将所有发酵瓶置于振荡频率 ５０ ｒ ／ｍｉｎ 和温度 ３９．５ ℃的培养箱中预热 。取出发酵瓶 ，通入二氧 化碳以保证发酵瓶中为厌氧环境 ，用瓶口分液器 向每个发酵瓶中加入 ６０ ｍＬ 人工瘤胃培养液 ，并 将发酵瓶放入体外瘤胃发酵设备中进行发酵 ，７２ ｈ 后终止发酵 。 １．２．３ 样品采集和分析 首先用 ｐＨ 计 （Ｓｔａｒｔｅｒ ３００，上海奥豪斯仪器有 限公司 ）对每个发酵瓶中的发酵液进行 ｐＨ 测定 。然后取 ２ ｍＬ 发酵液 ，１５ ０００ ｒ ／ｍｉｎ 和 ４ ℃条件下 离心 １０ ｍｉｎ ，取 １．５ ｍＬ 上清液 ，加入 ０．１５ ｍＬ ２５％偏磷酸固定 ，静置 １５ ｍｉｎ 后 ，－２０ ℃保存 。样品在 常温条件下解冻 ，１５ ０００ ｒ ／ｍｉｎ 和 ４ ℃条件下离心 １０ ｍｉｎ ，取 ０．６ ｍＬ 装于测定瓶中 ，采用气相色谱仪 测定发酵液样品中挥发性脂肪酸组分 ［１７］。 然后取 ２ ｍＬ 发酵液 ，放入液氮中速冻 ，最后 置于 －８０ ℃冰箱保存 ，用于微生物数量分析 。试 验采用 Ｑｉａｇｅｎ 公司的 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 试剂盒 ，按照试剂盒的说明书对微生物 ＤＮＡ 进行 提取 。提取的 ＤＮＡ 首先用微量紫外分光光度计 ＮＤ－ １０００测定其核酸浓度 （ｎｇ／μ Ｌ ）及纯度 （ＯＤ２６０ ｎｍ／ ＯＤ２８０ ｎｍ ），最后用 ０．８％凝胶电泳检测其 完整性 ，剩余的 ＤＮＡ 置于 －８０ ℃保存 。实时荧光 定量 ＰＣＲ 试验用于对总细菌 、甲烷菌 、真菌 、原虫 及一些功能细菌 （产琥珀酸丝状杆菌 、反刍月星单 胞菌 ）进行定量分析 ，使用的引物序列见表 ２。然 后用 １．８％凝胶电泳检测 ＰＣＲ 产物 ，数据结果以 ｌｇ ｃｏｐｉｅｓ ／ ｍＬ 表示 ［１８］。最后剩余的发酵液用 ３００目的尼龙纱布进行过滤 ，然后置于 １０５ ℃烘箱中 烘至恒重 。根据底物重量和烘干之后的发酵底物 重量 ，计算干物质消失率 。 表 ２ 微生物的引物序列 Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｅｓ 目标种类 引物序列 大小 Ｓｉｚｅ ／ ｂｐ 文献 Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ 扩增效率 Ｐｒｉｍｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％ Ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （５′—３′） 总细菌 Ｆ：ＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ １４６ ［１９］ １００．４ Ｔｏｔａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒ：ＣＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣ 原虫 Ｆ：ＧＣＴＴＴＣＧＷＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴ Ｒ：ＣＴＴＧＣＣＣＴＣＹＡＡＴＣＧＴＷＣＴ ２２３ ［２０］ ９６．３ Ｐｒｏｔｏｚｏａ 甲烷菌 Ｆ：ＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＳＧＧＴＡＧＴ Ｒ：ＧＴＴＧＡＲＴＣＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＣＡ １９２ ［２１］ １０１．９ Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ 真菌 Ｆ：ＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣ Ｒ：ＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＧＴＡＧＧＡＴＧＡＴＴ １２０ ［１９］ ９７．２ Ｆｕｎｇｉ 反刍月星单胞菌 Ｆ：ＣＡＡＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧ １３８ ［２２］ １０２．２ Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ Ｒ：ＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ 产琥珀酸丝状杆菌 Ｆ：ＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡ Ｒ：ＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＣ １２１ ［１９］ １００．７ Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ １．３ 数据计算和统计 甲烷和氢气在不同时间点的产量可以按照下 面的公式进行计算 ： 式中 ：ｙ 代表的是甲烷和氢气在 １２、２４或 ３６ ｈ 的产量 （ｍＬ／ｇ ）；ｔ 代表的是不同时间点 （１２、２４和 ３６ ｈ ）；ｔ １和 ｔ ２分别代表与 ｔ 时间点相邻 ，且分别低 于和高于 ｔ 时间点 ；ｙ １和 ｙ ２分别代表氢气或甲烷 在 ｔ １和 ｔ ２时的产量 。 采用 ＳＰＳＳ ２１．０软件对数据进行一般线性模 型 （ＧＬＭ ）单因素方差分析 （ｏｎｅ⁃ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ）和 Ｄｕｎｃａｎ 氏多重比较 。统计模型中包括底物 、延胡 索酸 、底物 ×延胡索酸 ，统计学显著水平为 Ｐ ＜０．０５。 ２ 结果与分析 ２．１ 延胡索酸对体外模拟瘤胃 ７２ ｈ 产气量和 干物质消失率的影响 由表 ３可知 ，玉米粉的干物质消失率 、７２ ｈ 产 气量均显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５）；延胡索酸对干物 质消失率 、矫正产气量无显著影响 （Ｐ ＞０．０５），显著 增加 ７２ ｈ 产气量 （Ｐ ＜０．０５）；延胡索酸和底物对干 物质消失率 、７２ ｈ 产气量和矫正产气量均不存在 显著交互作用 （Ｐ ＞０．０５）。 表 ３ 不同添加水平的延胡索酸对体外模拟瘤胃 ７２ ｈ 产气量和干物质消失率的影响 Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ７２ ｈ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＭ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ 项目 干物质消失率 产气量 矫正产气量 Ｉｔｅｍｓ ＤＭＤ／％ Ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／（ｍＬ／ｇ） Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／（ｍＬ／ｇ） 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０ ７０．０ ２１３ａ ２１３ 菊苣 ３ ７０．０ ２２０ｂ ２１４ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ ７０．７ ２２７ｃ ２１４ １２ ７０．８ ２４７ｄ ２１２ ０ ８６．８ ３８４ａ ３８６ 玉米粉 ３ ８７．１ ４０３ｂ ３８６ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ ８７．５ ４２１ｃ ３８６ １２ ８８．０ ４４８ｄ ３８８ ＳＥＭ ０．５５２ ２．８０９ ３．４３２ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ０ ７８．２ ２９８ａ ２９９ 延胡索酸 ３ ７８．５ ３１２ｂ ２９９ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６ ７９．１ ３２４ｃ ３００ １２ ７９．３ ３４８ｄ ３０１ 底物 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ ７０．２ａ ４１４ａ ３８７ｂ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ８７．４ｂ ２２６ｂ ２１３ａ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ０．４７ ＜０．０５ ０．９４ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 ０．９９ ０．５３ ０．９９ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著 （Ｐ ＜０．０５）。矫正产气量是发酵瓶中总的产气量减去对应添加水平的延胡索 酸自身产气量 。下表同 。 Ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ， ｖａｌｕｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ （Ｐ ＜０．０５） ． Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｇａｓ ｐｒｏ⁃ｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｔｔｌｅ ａｎｄ ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｆｕｍａｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ． ２．２ 延胡索酸对体外模拟瘤胃不同时间点氢气和 甲烷产量的影响 由表 ４和表 ５可知 ，玉米粉的氢气产量和矫正 氢气产量只有在 １２ ｈ 显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５），而 ２种底物在其他时间点的氢气产量和矫正氢气产 量无显著差异 （Ｐ ＞０．０５）；玉米粉的甲烷产量和矫 正甲烷产量显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５）；延胡索酸对 不同时间点甲烷产量 、矫正甲烷产量和氢气产量 、氢气矫正产量均无显著影响 （Ｐ ＞０．０５）；延胡索酸 和底物对不同时间点的氢气和甲烷产量不存在显 著交互作用 （Ｐ ＞０．０５）。 ２．３ 延胡索酸对体外模拟瘤胃挥发性脂肪酸 组成的影响 由表 ６和表 ７可知 ，玉米粉的乙酸 、丙酸 、丁 酸 、异丁酸 、戊酸 、异戊酸 、总挥发性脂肪酸浓度均 显著高于菊苣 （Ｐ ＜０．０５），玉米粉的乙丙比 、ｐＨ 显 著低于菊苣 （Ｐ ＜０．０５）；延胡索酸显著升高了乙酸 、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度 （Ｐ ＜０．０５），显著降低 了乙丙比 （Ｐ ＜０．０５），对乙酸 、丙酸和总挥发性脂肪 酸浓度均无显著影响 （Ｐ ＞０．０５）；延胡索酸和底物 对挥发性脂肪酸浓度不存在显著交互作用 （Ｐ ＞０．０５）。 表 ４ 不同添加水平延胡索酸对不同时间点体外模拟瘤胃氢气产量的影响 Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ ｍＬ／ｇ 项目 Ｉｔｅｍｓ 氢气产量 Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 矫正氢气产量 Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ 底物 延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０ ０．０６ ０．２５ ０．３２ ０．２０ ０．０６ ０．２５ ０．３２ ０．２０ 菊苣 ３ ０．０６ ０．２９ ０．３３ ０．２５ ０．０５ ０．２８ ０．３３ ０．２６ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ ０．０６ ０．２０ ０．４０ ０．２８ ０．０６ ０．１９ ０．３８ ０．２８ １２ ０．０７ ０．１７ ０．３４ ０．３０ ０．０４ ０．１４ ０．３３ ０．２９ ０ ０．２７ ０．４０ ０．３４ ０．３１ ０．２７ ０．４０ ０．３４ ０．３１ 玉米粉 ３ ０．２５ ０．３６ ０．３１ ０．２９ ０．２４ ０．３５ ０．３１ ０．２９ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ ０．２５ ０．２９ ０．２７ ０．２５ ０．２４ ０．２８ ０．２５ ０．２５ １２ ０．１７ ０．２３ ０．２３ ０．１９ ０．１５ ０．２０ ０．２１ ０．１９ ＳＥＭ ０．０３７ ０．０７９ ０．０６６ ０．０４９ ０．０３８ ０．０７９ ０．０６７ ０．０５１ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ０ ０．１６ ０．３３ ０．３３ ０．２５ ０．１６ ０．３３ ０．３３ ０．２５ 延胡索酸 ３ ０．１６ ０．３３ ０．３２ ０．２７ ０．１５ ０．３２ ０．３２ ０．２７ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６ ０．１６ ０．２４ ０．３３ ０．２７ ０．１５ ０．２３ ０．３２ ０．２７ １２ ０．１２ ０．２０ ０．２９ ０．２５ ０．０９ ０．１７ ０．２７ ０．２４ 底物 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ ０．０４ａ ０．２３ ０．３５ ０．２６ ０．０４ａ ０．２２ ０．３４ ０．２６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ０．２３ｂ ０．３２ ０．２９ ０．２６ ０．２２ｂ ０．３１ ０．２８ ０．２６ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＜０．０５ ０．２６ ０．３８ ０．９３ ＜０．０５ ０．２６ ０．３９ ０．９３ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ０．８５ ０．６０ ０．９５ ０．９８ ０．６９ ０．８４ ０．９３ ０．９７ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ ０．７５ ０．９７ ０．８２ ０．４９ ０．７６ ０．９７ ０．８３ ０．５２ 表 ５ 不同水平延胡索酸对不同时间点体外模拟瘤胃甲烷产量的影响 Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ｍｅｔｈａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ ｍＬ／ｇ 甲烷产量 ＣＨ４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 矫正甲烷产量 Ｉｔｅｍｓ Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ＣＨ４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ 底物 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ０ ２．２４ ９．１９ １４．７１ １８．９４ ９．１９ １８．９２ 菊苣 ３ ２．１８ ９．４４ １４．６２ ２３．８１ ２．２４ １４．７１ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ ２．５８ ８．５２ １３．６１ ２２．４１ ２．３７ ８．１９ １３．２３ ２２．５３ １２ ２．８５ ８．０５ １２．６４ ２１．９２ ２．５５ ７．２９ １２．０１ ２０．９２ ０ ２３．２１ ３４．６４ ４２．２５ ４７．１３ ２３．２２ ３４．６２ ４２．２２ ４７．１４ 玉米粉 ３ ２２．７２ ３５．０３ ４３．４２ ５０．５４ ２２．４３ ３４．７４ ４３．０３ ４９．７１ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ ２３．３１ ３５．３１ ４３．６３ ５３．１１ ２３．１１ ３４．９１ ４３．２４ ５２．４３ １２ ２３．２２ ３４．２４ ４２．０９ ５０．６２ ２２．９２ ３３．４３ ４１．３１ ４９．６１ ＳＥＭ ０．９３１ １．９６６ ３．０７９ ４．４３３ ０．９３０ １．９７８ ３．１０８ ４．５４７ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ 续表 ５ 甲烷产量 矫正甲烷产量 项目 ＣＨ４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ＣＨ４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｔｅｍｓ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ １２ ｈ ２４ ｈ ３６ ｈ ７２ ｈ ０ １２．７１ ２１．９２ ２８．４１ ３４．０２ １２．７２ ２１．９１ ２８．４２ ３４．０３ 延胡索酸 ３ １２．４２ ２２．２１ ２９．０４ ３４．２３ １２．２４ ２１．９２ ２８．７１ ３７．０１ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６ １２．９３ ２１．９３ ２８．６２ ３４．９１ １２．７２ ２１．６３ ２８．２３ ３７．６２ １２ １３．０４ ２１．１２ ２７．３３ ３４．８４ １２．７１ ２０．３１ ２６．６２ ３６．８４ 底物 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ ２．５２ａ ８．８３ａ １３．９２ａ ２１．９２ａ ２．３３ａ ８．４２ａ １３．５４ａ ２０．０１ａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ２３．１２ｂ ３４．８３ｂ ４２．８１ｂ ５０．３３ｂ ２２．９２ｂ ３４．４３ｂ ４２．４２ｂ ４８．５２ｂ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ０．９７ ０．９８ ０．９８ ０．９９ ０．９７ ０．９４ ０．９７ ０．８９ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 ０．９２ ０．９１ ０．９４ ０．９０ ０．８９ ０．９７ ０．８６ ０．９６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ 表 ６ 不同添加水平延胡索酸对挥发性脂肪酸组分的影响 Ｔａｂｌｅ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ＶＦＡ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ 总挥发性 乙酸 丙酸 丁酸 异丁酸 戊酸 异戊酸 脂肪酸 乙丙比 项目 Ａｃｅｔａｔｅ ／ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ／ Ｂｕｔｙｒａｔｅ ／ Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ ／ Ｖａｌｅｒａｔｅ ／ Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ ／ Ａｃｅｔａｔｅ ／ ｐＨ Ｉｔｅｍｓ ＴＶＦＡ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） 底物 延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０ ５３．４８ａ ３７．５２ａ ９．３４ａ ３．６５ １．１５ ０．６９ １．１１ ４．０６ｃ ６．９１ｃ 菊苣 ３ ６０．０４ｂ ４１．９０ｂ １１．３４ｂ ３．７９ １．１６ ０．７０ １．１５ ３．６９ｂｃ ６．８０ｂｃ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ ６５．９６ｃ ４５．４３ｃ １３．８９ｃ ３．６２ １．１６ ０．７１ １．１６ ３．２８ａｂ ６．７３ａｂ １２ ８０．６５ｄ ５４．６３ｄ １９．２０ｄ ３．８１ １．１７ ０．７０ １．１４ ２．８５ａ ６．５９ａ ０ ８４．２０ａ ４７．８８ａ １７．４６ａ １３．１２ １．５４ ２．２９ １．９１ ２．７４ｂ ６．７１ｃ 玉米粉 ３ ８８．６２ａ ５０．１０ａｂ １９．３９ｂ １３．３８ １．６０ ２．２７ １．８９ ２．５８ｂ ６．５７ｂ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ ９６．６０ｂ ５４．３８ｂ ２２．３５ｃ １３．９５ １．７３ ２．２１ １．９８ ２．４４ｂ ６．４８ａｂ １２ １０７．８７ｃ ５９．３１ｃ ２９．１６ｄ １３．３２ １．８９ ２．２１ １．９８ ２．０４ａ ６．４０ａ ＳＥＭ １．１３９ ０．８１９ ０．３３６ ０．４２６ ０．０７９ ０．０７２ ０．０７４ ０．０９７ ０．０３４ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ０ ６８．８４ａ ４２．７０ａ １３．４０ａ ８．３８ １．３５ １．４９ １．５１ ３．４０ｃ ６．８１ｄ 延胡索酸 ３ ７４．３３ｂ ４６．００ｂ １５．３７ｂ ８．５８ １．３８ １．４９ １．５２ ３．１４ｂｃ ６．６８ｃ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／ ６ ８１．２８ｃ ４９．９１ｃ １８．１２ｃ ８．７９ １．４５ １．４６ １．５７ ２．８６ｂ ６．６１ｂ （ｍｍｏｌ／Ｌ） １２ ９３．２６ｄ ５６．９７ｄ ２４．１８ｄ ８．５７ １．５３ １．４５ １．５６ ２．４４ａ ６．４９ａ 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ ６５．０３ａ ４４．８７ａ １３．４４ａ ３．７２ａ １．１６ａ ０．７０ａ １．１４ａ ３．４７ｂ ６．７６ｂ 底物 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ９４．３２ｂ ５２．９２ｂ ２２．０９ｂ １３．４４ｂ １．６９ｂ ２．２４ｂ １．９４ｂ ２．４５ａ ６．５４ａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ０．９３ ０．４０ ０．９８ ０．９３ ＜０．０５ ＜０．０５ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ ０．６５ ０．１３ ０．１９ ０．８７ ０．４８ ０．９６ ０．９６ ０．２５ ０．９８ 表 ７ 不同水平延胡索酸对体外模拟瘤胃矫正挥发性脂肪酸组分的影响 Ｔａｂｌｅ ７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ＶＦＡ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ 总挥发性 乙酸 丙酸 丁酸 异丁酸 戊酸 异戊酸 乙丙比 脂肪酸 项目 Ａｃｅｔａｔｅ ／ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ／ Ｂｕｔｙｒａｔｅ ／ Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ ／ Ｖａｌｅｒａｔｅ ／ Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ ／ Ａｃｅｔａｔｅ ／ Ｉｔｅｍｓ ＴＶＦＡ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ （ｍｍｏｌ／ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） Ｌ） 底物 延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０ ５２．８２ ３８．１９ ８．６８ ３．６５ ０．６５ ０．５６ ０．８９ ４．４０ 菊苣 ３ ５０．８７ ３７．２２ ８．５９ ３．０１ ０．６６ ０．５５ ０．８４ ４．３６ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ ５１．３２ ３７．８９ ８．４４ ３．０４ ０．６４ ０．５３ ０．７９ ４．４９ １２ ５３．７１ ３９．４２ ８．５９ ３．６４ ０．６４ ０．５９ ０．８４ ４．６０ ０ ８２．０３ ４６．８８ １７．４６ １３．１２ １．２１ ２．０２ １．３４ ２．６９ 玉米粉 ３ ７７．１４ ４４．３０ １６．２６ １２．０２ １．１８ ２．０２ １．３６ ２．７２ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ ７９．２８ ４４．７１ １７．５３ １２．３３ １．２２ ２．１３ １．３７ ２．５５ １２ ８０．５３ ４５．６０ １７．７２ １２．６５ １．２２ ２．０５ １．２９ ２．５９ ＳＥＭ １．９５６ １．１７３ ０．４７１ ０．３３３ ０．０９３ ０．０３０ ０．０５１ ０．０８８ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ 延胡索酸 ０ ６７．４２ ４２．５４ １３．０７ ８．３８ ０．９３ １．２９ １．２２ ３．５４ Ｆｕｍａｒａｔｅ ３ ６４．００ ４０．７６ １２．４３ ７．５２ ０．９２ １．２８ １．１０ ３．５４ （ｍｍｏｌ／Ｌ） ６ ６５．３０ ４１．３０ １２．９８ ７．６８ ０．９３ １．３３ １．０８ ３．５２ １２ ６７．１２ ４２．５１ １３．１５ ８．１４ ０．９３ １．３２ １．０６ ３．５９ 底物 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ ５２．１８ａ ３８．１８ａ ８．５７ａ ３．３４ａ ０．６５ａ ０．５６ａ ０．８９ａ ４．４６ｂ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ７９．７４ｂ ４５．３７ｂ １７．２４ｂ １２．５３ｂ １．２１ｂ ２．０５ｂ １．３４ｂ ２．６４ａ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ ＜０．０５ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ０．５８ ０．６４ ０．７０ ０．２６ ０．９８ ０．６１ ０．１７ ０．９５ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 ０．９５ ０．８９ ０．６７ ０．９５ ０．９９ ０．３５ ０．１６ ０．４０ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ 矫正挥发性脂肪酸浓度是延胡索酸组发酵瓶中挥发性脂肪酸浓度与对应空白发酵瓶中挥发性脂肪酸浓度的差值 。Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ＶＦＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＶＦＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｏｔｔｌｅ ａｎｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＶＦＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｆｕｍａｒａｔｅ． ２．４ 延胡索酸对体外模拟瘤胃微生物数量的影响 由表 ８可知 ，玉米粉的原虫数量显著高于菊 苣 （Ｐ ＜０．０５）；延胡索酸对总细菌 、原虫 、真菌 、产琥 珀酸丝状杆菌 、反刍月星单胞菌和甲烷菌数量均 无显著影响 （Ｐ ＞０．０５）；延胡索酸和底物对微生物 数量不存在显著交互作用 （Ｐ ＞０．０５）。 ３ 讨 论 ３．１ 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃 产气量和干物质消失率的影响 饲料经瘤胃微生物发酵后的产气量是衡量饲 料可发酵程度的重要指标 ，产气量通常与干物质 消失率呈正相关 ［２３］。富含易发酵碳水化合物的玉 米粉更容易被微生物利用 ，产生更多的气体 ［２４］。而菊苣中更多的中性和酸性洗涤纤维不适合微生 物附着和生长 ，影响其发酵速率和程度 。研究结 果表明 ，延胡索酸可以显著增加总产气量 ［２５－２６］。但是 ，在本试验结果中 ，延胡索酸对干物质消失率 无显著影响 ，这可能与延胡索酸在瘤胃中自身降 解可以代谢产生二氧化碳密切相关 。 Ｄｅｍｅｙｅｒ 等 ［２７］报道 ，延胡索酸通过琥珀酸 －丙酸代谢途径 ，最终会产生二氧化碳 ，导致产气量升高 。延胡索 酸对矫正产气量没有显著影响 ，这与干物质消失 率没有发生变化相一致 。 表 ８ 不同添加水平延胡索酸对体外模拟瘤胃微生物数量的影响 Ｔａｂｌｅ ８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｕｍｅｎ ｌｇ ｃｏｐｉｅｓ ／ ｍＬ 项目 总细菌 原虫 真菌 甲烷菌 产琥珀酸丝状杆菌 反刍月星单胞菌 Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ Ｉｔｅｍｓ Ｔｏｔａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｒｏｔｏｚｏａ Ｆｕｎｇｉ Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ 底物 延胡索酸 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０ １０．９５ ６．０１ ５．３１ ８．４６ ７．７９ ８．５２ 菊苣 ３ １０．９２ ５．９０ ５．３１ ８．４５ ７．７５ ８．５３ Ｃｈｉｃｏｒｙ ６ １０．９４ ６．００ ４．９８ ８．３９ ７．９５ ８．４９ １２ １１．０９ ６．５３ ５．２４ ８．４６ ７．９０ ８．５５ ０ １１．１１ ６．７２ ５．２２ ８．４９ ７．１４ ８．５０ 玉米粉 ３ １１．０４ ６．５６ ５．４２ ８．５１ ７．００ ８．５８ Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ６ １１．１２ ６．７５ ５．２１ ８．４３ ７．３３ ８．５９ １２ １１．２１ ７．１３ ５．１９ ８．４８ ７．７１ ８．５６ ＳＥＭ ０．１６７ ０．３１４ ０．１７２ ０．１３７ ０．３９３ ０．１１１ 主效应 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ０ １１．０１ ６．３６ ５．２７ ８．４７ ７．４６ ８．５１ 延胡索酸 ３ １１．０３ ６．２３ ５．３７ ８．４８ ７．３７ ８．５５ Ｆｕｍａｒａｔｅ ／ ６ １１．０１ ６．３８ ５．１０ ８．４１ ７．６４ ８．５４ （ｍｍｏｌ／Ｌ） １２ １１．１２ ６．８３ ５．２２ ８．４７ ７．８０ ８．５６ 底物 菊苣 Ｃｈｉｃｏｒｙ １１．０３ ６．１１ａ ５．２１ ８．４４ ７．８５ ８．５２ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 玉米粉 Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ １１．１２ ６．７９ｂ ５．２６ ８．４８ ７．２９ ８．５６ 底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ０．５４ ０．０４ ０．７７ ０．７８ ０．１８ ０．７５ Ｐ值 延胡索酸 Ｆｕｍａｒａｔｅ ０．９３ ０．５６ ０．７４ ０．９８ ０．８７ ０．９９ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 底物×延胡索酸 ０．９９ ０．９９ ０．９１ ０．９８ ０．９６ ０．９８ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ×ｆｕｍａｒａｔｅ ３．２ 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃 甲烷和氢气产气量的影响 本试验中 ，玉米粉的甲烷产量高于菊苣 ，这可 能是因为玉米粉有助于甲烷菌生长 ，可以产生更 多的甲烷 。但是 ，在本试验结果中 ，２种底物的甲 烷菌数量没有显著差异 ，这可能是因为甲烷产量 除了与甲烷菌数量有关 ，还与甲烷菌活性有关 ［２８］。氢是伴随着挥发性脂肪酸产生的中间产物 ，在 １２ ｈ 时 ，玉米粉的氢气产量显著高于菊苣 ，之后无显著 差异 ，这可能是因为氢产量的增加会刺激甲烷菌 对氢的利用 ，从而使氢分压维持平衡 ［２９］。延胡索 酸利用氢气还原生成琥珀酸的过程中所需要的自 由能为 －１２８．８ Ｊ ／ｍｏｌ ，而甲烷菌利用氢气和二氧化 碳合成甲烷所需要的自由能为 －１６．９ Ｊ ／ｍｏｌ 。与甲 烷合成相比 ，延胡索酸还原成琥珀酸的过程所需 要的氢分压更低 ，释放的能量能多 。这说明延胡 索酸可以作为氢池参与消耗氢的反应 。 Ｃａｓｔｒｏ⁃ｍｏｎｔｏｙａ 等 ［３０］研究结果表明 ，在体外条件下 ，２．３３ ｇ／Ｌ 的延胡索酸可以降低 ３５％甲烷的生成 。Ｂａｙａｒｕ 等 ［３１］研究结果表明 ，在奶牛饲粮中添加 ２％的延胡索酸可以减少 ２３％的甲烷排放 。但是 ，Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ 等 ［３２］研究结果表明 ，在肉牛饲粮中添 加 １０ ｇ／ｋｇ 的延胡索酸对甲烷排放并没有显著影 响 。在本研究结果中 ，延胡索酸对不同时间点的 氢气和甲烷产量均无显著影响 。 Ｕｎｇｅｒｆｅｌｄ 等 ［５］报 道 ，１ ｍｏｌ 延胡索酸通过琥珀酸被还原成丙酸的过 程中会消耗 ２ ｍｏｌ 的氢 ［Ｃ４Ｈ ４ Ｏ ４ ＋ ２ Ｈ → Ｃ ３ Ｈ ６ Ｏ ２ ＋ＣＯ２］，即还原 １ ｍｏｌ 的延胡索酸可以降低 ０．２５ ｍｏｌ 甲烷产生 。但是 ，１ ｍｏｌ 延胡索酸通过苹果酸 －丙 酮酸转变成乙酸的过程中会产生 ４ ｍｏｌ 的氢 ［Ｃ４Ｈ４Ｏ４＋２Ｈ２Ｏ →Ｃ２Ｈ４Ｏ２＋２ＣＯ２＋４Ｈ ］，即 １ ｍｏｌ 的延胡索酸可以增加 ０．５ ｍｏｌ 甲烷产生 。延胡索 酸对甲烷和氢气产量没有影响 ，说明在延胡索酸 被还原成琥珀酸的过程中 ，被消耗的氢几乎抵消 了延胡索酸代谢产生乙酸所释放的氢 。 ３．３ 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃 ｐＨ 和挥发性脂肪酸组成的影响 和菊苣相比 ，玉米粉富含非结构性碳水化合 物 ，很容易被微生物降解产生更多的挥发性脂肪 酸 ，从而使 ｐＨ 降低 ［２６］。延胡索酸是一种有机酸 ，具有一定的酸性 ［３３］。 Ｒｅｍｌｉｎｇ 等 ［３４］报道 ，添加延 胡索酸后 ，瘤胃液 ｐＨ 由 ６．０８降低到 ５．９３，这与本 研究结果相一致 。但是 ，有些研究结果表明 ，添加 延胡索酸会升高瘤胃 ｐＨ ［８］，这可能与微生物增加 了对延胡索酸的利用有关 ［３５］。 挥发性脂肪酸浓度和组成是衡量瘤胃发酵模 式的重要指标 。延胡索酸在体外发酵过程中 ，一 方面在黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体 （ＦＡＤＨ２）作用 下生成琥珀酸 ，然后与辅酶 Ａ 的巯基形成硫脂键 ，在变位酶维生素 Ｂ１２催化下 ，将生成的琥珀酰辅酶 Ａ 转变成甲基丙二酸单酰辅酶 Ａ ，在丙酰辅酶羧化 酶和生物素的催化下 ，转变成丙酰辅酶 Ａ ，最后在 丙酰辅酶 Ａ 转移酶的作用下生成丙酸 ，最终导致 丙酸浓度增加 ［５］；另一方面 ，在延胡索酸酶的作用 下 ，与水反应生成苹果酸 ，在苹果酸脱氢酶的作用 下生成草酰乙酸 ，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催 化下 ，形成磷酸烯醇式丙酮酸 ，在丙酮酸激酶催化 下形成丙酮酸 ，在丙酮酸脱氢酶复合体的作用下 生成乙酰辅酶 Ａ ，然后在磷酸作用下生成乙酰磷 酸 ，最终在酸性条件下分解产生乙酸 ，最终导致乙 酸浓度增加 ［５］。在本试验中 ，延胡索酸增加了乙 酸 、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度 ，但矫正乙酸 、丙 酸和总挥发性脂肪酸浓度无显著变化 。这表明延 胡索酸对挥发性脂肪酸浓度及组成的改变主要与 自身代谢有关 ，对底物本身的发酵模式没有影响 。 ３．４ 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃 微生物数量的影响 在本试验中 ，玉米粉更有助于提高原虫数量 ，这可能与原虫更多的降解淀粉有密切关系 ［３６］。有 研究结果表明 ，延胡索酸有助于促进产琥珀酸丝 状杆菌 、琥珀酸放线菌和产琥珀酸沃廉菌的增殖 ，从而促进和甲烷菌同时竞争氢的利用 ［２６］。在本研 究中 ，延胡索酸对总细菌 、原虫 、真菌 、甲烷菌 、反 刍月星单胞菌和产琥珀酸丝状杆菌数量均没有显 著影响 。这可能与发酵底物 、延胡索酸的添加水 平 、发酵时间和试验条件 （连续发酵培养或单批体 外发酵 ）有关 。 ４ 结 论 ①玉米粉富含更多容易降解的淀粉 ，这会有 助于其瘤胃发酵产生更多的气体和挥发性脂 肪酸 。 ②在体外模拟瘤胃发酵条件下 ，延胡索酸 （≤１２ ｍｍｏｌ／Ｌ ）对不同类型发酵底物的干物质消失 率 、不同时间点的甲烷和氢气产量 、微生物数量无 显著影响 。 ③延胡索酸显著增加了体外产气量 、乙酸 、丙 酸和总挥发性脂肪酸浓度 ，降低了乙丙比 ，这与延 胡索酸通过自身代谢产生额外的二氧化碳 、乙酸 、丙酸密切相关 。 参考文献 ： ［ １］ ＸＵ Ｇ Ｑ ，ＺＯＵ Ｗ ，ＣＨＥＮ Ｘ Ｌ ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏ⁃ｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ａｉｄｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ［ Ｊ ］ ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ，２０１２，７（１２）：ｅ５２０８６． ［ ２］ ＹＩＮ Ｘ ，ＬＩ Ｊ Ｈ ，ＳＨＩＮ Ｈ Ｄ ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒ⁃ｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ：ａｄ⁃ｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ，２０１５，３３（６）：８３０－８４１． ［ ３］ ＫＩＭ Ｓ Ｈ ，ＭＡＭＵＡＤ Ｌ Ｌ ，ＫＩＭ Ｄ Ｗ ，ｅｔａｌ．Ｆｕｍａｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ ｒｅｄｕｃｅ ｍｅｔｈａｎｅ ｐｒｏ⁃ｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｕｍｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，２０１６，２６（３）：５５８－５６６． ［ ４］ ＡＲＡＵ′ ＪＯ Ｗ Ｌ ，ＮＵＮＥＳ⁃ＮＥＳＩ Ａ ，ＦＥＲＮＩＥ Ａ Ｒ．Ｆｕ⁃ｍａｒａｔｅ ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ［ Ｊ ］ ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２０１１，７２（９）：８３８－８４３． ［ ５］ ＵＮＧＥＲＦＥＬＤ Ｅ Ｍ ，ＫＯＨＮ Ｒ Ａ ，ＷＡＬＬＡＣＥ Ｒ Ｊ ，ｅｔ ａｌ． Ａ Ｍｅｔａ⁃ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｕｍａｒａｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍｅｔｈａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｕｍｉｎａｌ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ，２００７，８５（１０）：２５５６－２５６３． ［ ６］ ＵＮＧＥＲＦＥＬＤ Ｅ Ｍ．Ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｒｕｍｉｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｉｎｋｓ ［ Ｊ ］ ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ⁃ｏｇｙ ，２０１３，４：３１９． ［ ７］ ＡＢＲＡＲ Ａ ，ＫＯＮＤＯ Ｍ ，ＫＩＴＡＭＵＲＡ Ｔ ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｒａｎ ａｎｄ ｆｕｍａｒａｔｅａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｕｍｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ，ｍｅｔｈａ⁃ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ ［ Ｊ ］ ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒ⁃