在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸

本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 - 线性离子阱质谱仪 （Vanquish Duo-LTQ XL）在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析 方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42 秒（包括进样针清洗、 进样和质谱数据采集），利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品 进行快速除盐分析，测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm （表 4）。建立的在线除盐方法快速简便，质谱鉴定准确度高，样 品分析周期非常短（42 秒），24h 内可以分析高达 2000 个样品， 满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。thermoscientific 在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸 杨艳 1，程汉兴 1，刘晓达 1，金燕 1* 赛默飞世尔科技（中国）有限公司色谱质谱部 关键词:在线脱盐，高通量，寡核苷酸，液质联用 前言 寡核苷酸是一类短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸及核糖核 酸），如用于基因扩增和基因诊断的 PCR 引物和反义核酸，介导 基因沉默的小干扰 RNA （small interfering RNA ，siRNA ）等，努力 研究开发基因靶向治疗药物用于治疗病毒、肿瘤和遗传疾病。天然 的寡核苷酸在体内容易降解，稳定性差。通过修饰的寡核苷酸具有 较好的药学特性和体内稳定性 [1-2]，但合成的寡核苷酸产物含有各 种杂质，需纯化精制，产物的鉴定和产品的质量控制至关重要。 液相和液质联用于寡核苷酸目标产物的高分辨分离和鉴定，可以 判断待测寡核苷酸结构的变化，比如脱嘌呤、氧化、磷酸化等。寡 核苷酸样品中存在的盐分会影响其离子化过程和造成峰强度降低，因此有必要进行质谱鉴定前的除盐处理。常规离线除盐方法耗时；可以利用在线除盐方式进行寡核苷酸的分离鉴定，但样品通量需要 提高，以满足高通量的要求，如平均每天 2000个样品的需求等。 本工作中，我们利用阀切换技术 [3-5]对寡核苷酸样品进行在线 除盐，建立简单、快速、高效的超高效液相色谱线性离子阱 质谱仪（Vanquish Duo-LTQ XL ）在线除盐和寡核苷酸分子量 测定的分析方法。 实验方法 1.仪器和耗材 •包括下列模块和组件的 Thermo Vanquish Duo 超高效液相色 谱系统 泵：Dual Pump （P/N VF-P32-A ） 自动进样器：Split Sampler FT （P/N VF-A10-A ） 柱温箱：Column Compartment H （VH-C10-A ） •质谱仪：Thermo ScientificTM LTQ-XL 质谱 •分流器：Analytical Scientific Instruments （Model No.600-PO10-06） •色谱柱：Acclaim Polar Advantage II 2.试剂 甲醇（质谱级，Fisher 公司）、三乙胺（Sigma ）、六氟异丙醇（Sigma ），去离子水（18.2M Ω ） 3.样品 合成的不同分子量的寡核苷酸含盐的样品来源于客户。 4.色谱条件和质谱条件 色谱柱：Acclaim Polar Advantage II （C18-2×10 mm 5 pm ） 柱温：30℃ Vanquish Duo 右泵（平衡泵）流动相 A ：0.75%六氟异丙醇和 0.038%的三乙胺的水溶液 Vanquish Duo 左泵（分析泵）流动相 B ：0.75%六氟异丙醇和 0.038%的三乙胺和 90%甲醇溶液 色谱方法见表 1和表 2，质谱条件见表 3。 时间（min） 流速（mL/min） %A 0 2 100% 0.5 2 100% 表 1.右泵流路色谱方法 时间（min） 流速（mL/min） %B 0 1.5 100% 0.5 1.5 100% 表 2.左泵流路色谱方法 离子源参数 Sheath Gas Flow Rate 40 Aux Gas Flow Rate 10 Sweep Gas Flow Rate 0 Spray Voltage -3.5kv Capillary Temp 360 Capillary Voltage -20 Tube Lens -40 采集模式 负离子模式 扫描范围 50-2000 SID 30ev 表 3.质谱条件 脱 盐 柱 1:上 样 和 脱 盐 图 1.快速除盐的串联管路连接图（U 代表上阀，L 代表下阀） 实验结果与讨论 1.色谱柱串联在线除盐 [6] 利用图 1的串联配置可以加速脱盐和洗脱过程。在线除盐和分析的 整个过程主要分为两个部分：（1）样品上样至脱盐柱 1，在流速 2mL/min 的除盐水相条件下，样品中的盐快速被除去，待测样品保 留在脱盐柱上；（2）进行阀切换，洗脱有机相快速进入脱盐柱 1，将待测样品从脱盐柱 1上洗脱进入质谱检测。 2. Vanquish Duo 串联 MS （LTQ XL ）进行寡核苷酸定性分析 图 3-5所示，为寡核苷酸样品 S1和 S2的质谱总离子流谱 图，响应良好，测得质谱原始数据须保存为 Proflie 格式，通过 BioPharmaFinder 软件 Intact 分析进行去卷积分析，得到相应的寡 聚核苷酸样品分子量（图 6-8）和去卷积后匹配原始谱图（图 9-11） 图 3. S1寡核苷酸样品质谱总离子流谱图（TIC ） N L : 1.40E 7 s10 图 4. S2寡核苷酸样品质谱总离子流谱图（TIC ） NL : 1.06E 7 图 5. S3寡核苷酸样品质谱总离子流谱图（TIC ） 图 6. S1寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 7. S2寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 8. S3寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 9. S1寡核苷酸样品匹配原始质谱图 s10 #3-16 RT:0.063-0.435 A V:14 图 10. S2寡核苷酸样品原始质谱图 图 11. S3寡核苷酸样品原始质谱图 样品 理论分子量（Da） 实测分子量（Da） 差异 delta mass（Da） S1 29331.07 29333.57 2.50 S2 23010.91 23012.78 1.87 S3 26103.9 26106.29 2.39 表 4.实际测得分子量和理论分子量差异 结论 本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 -线性离子阱质谱仪 （Vanquish Duo-LTQ XL ）在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析 方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42秒（包括进样针清洗、进样和质谱数据采集），利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品 进行快速除盐分析，测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm （表 4）。建立的在线除盐方法快速简便，质谱鉴定准确度高，样 品分析周期非常短（42秒），24h 内可以分析高达 2000个样品，满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。 参考文献 1.贾巧云、邓新秀、高婵等 .反相离子对高效液相色谱法分析硫代反义寡 核苷酸 CT102相关杂质。药物分析杂质 2013,33（7）：1157-1162 2. Martin Gilar.,et al.Characterization of therapeutic oligonucleotides using liquid chromatography with on-line mass spectrometry detection[J].Oligo mucleotides,2003,13:229-243 3. 1. Opiteck G J, Lewis K C, Jorgenson J W, et al. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins[J]. Analytical Chemistry, 1997, 69(8):1518-1524. 4. 2.Wei J, Sun J, Yu W, et al. Global Proteome Discovery Using an Online Three-Dimensional LC−MS/MS[J]. Journal of Proteome Research, 2005,4(4):801-808. 5. 3.Yoshida H, Mizukoshi T, Hirayama K, et al. On-line desalting-mass spectrometry system for the structural determination of hydrophilic metabolites, using a column switching technique and a volatile ion-pairing reagent.[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1119(1):315-321. 6. on-line high-throughput desalting to prepare samples for mass spectrometry.application update 174