乳粉中维生素B6的含量测定 高效液相色谱法

抑制呕吐、营养神经、促进代谢、预防血栓、治疗贫血……维生素B6的功效你了解过吗？ 维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。 在乳粉中，维生素B6作为营养强化剂使用。其添加量应遵循《GB 14880-2012 食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》中的要求。对于婴幼儿配方乳粉中维生素B6的添加还应遵守其对应的产品标准《GB 10765-2010 食品安全国家标准 婴儿配方食品》及《GB 10767-2010 食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》。 检验其是否符合标准，可使用悟空K2025高效液相色谱仪测定。02 乳粉中维生素B6的含量测定高效液相色谱法 抑制呕吐、营养神经、促进代谢、预防血栓、治疗贫血……维生素B6的功效你了解过吗？ 维生素B6（VitaminB6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的 形式存在，是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。维生素B6为人体内某些辅酶 的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。 在乳粉中，维生素B6作为营养强化剂使用。其添加量应遵循《GB14880-2012食品安全国 家标准食品营养强化剂使用标准》中的要求。对于婴幼儿配方乳粉中维生素B6的添加还应 遵守其对应的产品标准《GB10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品》及《GB 10767-2010食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》。 检验其是否符合标准，可使用悟空K2025高效液相色谱仪测定。 01 实验准备 1、原理 样品经水提取，沉淀蛋白后，取上清液，采用液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。 2、色谱条件 悟空K2025高效液相色谱仪：K2025P2二元高压输液泵、K2025AS自动进样器、K2025CO 柱温箱、RF-20A荧光检测器、K2025ATD模数转换器、Wookinglab色谱工作站； 色谱柱：C18，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱； 流动相：流动相A为甲醇，流动相B为辛烷磺酸钠溶液，按下表进行梯度洗脱： 时间 (min) 流速 (mL/min) A (%) B (%) 0.0 1.000 10.0 90.0 3.0 1.000 10.0 90.0 10.0 1.000 35.0 65.0 22.0 1.000 35.0 65.0 23.0 1.000 10.0 90.0 30.0 1.000 10.0 90.0 柱温：35℃； 进样量：10μL； 检测器及波长：荧光检测器，激发波长为293nm，发射波长为395nm。 实验结果 重复性测试 色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。 图1维生素B6标准溶液的色谱图 表1维生素B6标准溶液色谱图积分结果 目标物 吡哆醛 吡哆醇 吡哆胺 保留时间 （min） 11.187 15.915 20.920 峰面积 （mAU.s） 102.393 617.887 97.286 峰高 (mAU) 4.959 68.193 12.448 理论塔板数 6758 71697 168237 分离度 - 12.09 22.67 对称/拖尾因子 1.06 1.07 1.12 由表1中数据可知，吡哆醛与吡哆醇的分离度为12.09，吡哆醇与吡哆胺的分离度为22.67，具有较好的分离度。三种物质的拖尾因子范围为1.06~1.12，均有良好的峰型。 将维生素B6标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。 图2维生素B6溶液连续进样7针叠加的色谱图 表2维生素B6溶液连续进样7针重复性数据统计 目标物吡哆醛 吡哆醇 吡哆胺 _ 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 1 11.187 102.393 15.915 617.887 20.920 97.286 2 11.173 102.624 15.908 620.260 20.900 97.216 3 11.173 102.272 15.912 618.631 20.908 97.314 4 11.168 102.193 15.903 618.940 20.888 98.037 5 11.180 102.411 15.907 619.105 20.888 97.824 6 11.162 102.390 15.905 620.355 20.893 97.816 7 11.163 102.484 15.910 619.127 20.895 97.624 平均值11.172 102.395 15.909 619.168 20.899 97.588 RSD% 0.081 0.136 0.026 0.141 0.056 0.328 由表2中数据可知，维生素B6各组分保留时间的RSD范围为0.026%~0.081%，峰面积的 RSD范围为0.136%~0.328%，均具有良好的定性定量重复性。 含量测定 校准曲线 将配制好的维生素B6混合标准工作液在HPLC上进行测定叠加色谱图见图3。维生素B6各 组分混合标准工作液在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2≥0.9995，线性关系均良好。 图3维生素B6混合标准工作液浓度系列曲线叠加色谱图 样品含量测定 以市售乳粉为样品，按照流程对样品进行处理，并计算样品中维生素B6各组分的含量。样品 的色谱图如图4所示。 图4乳4粉样品的色谱图 根据计算，此乳粉样品中维生素B6的含量为10.9mg/100g。 03 结论 通过对维生素B6各组分的峰型、重复性、灵敏度、线性的测试以及对乳粉样品中维生素B6的含量进行测定，实验结果表明： 用WookingK2025高效液相色谱仪测定维生素B6，维生素B6各组分峰分离度均大于1.5，三种物质的拖尾因子范围为1.06~1.12，具有良好的分离度及峰型；重复性测试中，将维生 素B6混合标准溶液连续进样7针，维生素B6各组分的保留时间的RSD范围为 0.026%~0.081%，峰面积的RSD范围为0.136%~0.328%，均有良好的定性定量重复性；维 生素B6各组分的仪器检出限均小于4.819ng/mL，仪器定量限均小于16.064ng/mL；在 测定浓度范围内，维生素B6各组分均具有良好的线性关系，确定系数R2均≥0.9995；乳粉 样品中维生素B6的含量为10.9mg/100g。 因此，WookingK2025高效液相色谱仪可以满足《GB5009.154-2016食品安全国家标准食 品中维生素B6的测定（第一法）》中维生素B6含量测定的需求。