虾肉中孔雀石绿和结晶紫残留量液相色谱-串联质谱法测定

虾肉中孔雀石绿和结晶紫残留量液相色谱-串联质谱法测定（Copure® ALN中性氧化铝柱）《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量测定》一、背景介绍孔雀石绿和结晶紫是人工合成的三苯甲烷类化合物，都属于工业染料，因其价格低廉且具有杀菌和驱虫的效果，曾广泛应用于水产养殖中，但孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的生物毒性较强，在生物体内长期累积会对人体造成危害。逗点生物结合自身产品优势，建立了固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法测定虾肉中的孔雀石绿和结晶紫含量的方法，样品在提取后，经中性氧化铝柱固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱-串联质谱仪测定。经验证，加标回收率范围90-110%，RSD值小于5%，满足要求。2、 仪器条件2.1 色谱条件仪器：UPLC-MS/MS（Thermo Fisher TSQ Endura）色谱柱：Commasil® Coreshell C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)流动相：A-水（0.1%甲酸）  B-乙腈（0.1%甲酸）洗脱方式：梯度洗脱，见表1表1 流动相梯度洗脱条件时间（min）流速（mL/min）%BCurve0.00.3551.50.36053.00.3100510.00.3100510.50.355150.355流速：0.3 mL/ min柱温：30 ℃进样量：10 μL2.2 质谱条件离子源：HESI         电喷雾电压：3500 V鞘气压力：15 arb       辅气压力：1 arb离子传输管：360 ℃     辅气温度：380 ℃表2 孔雀石绿和结晶紫离子对参数（*为定量离子）CompoundPrecursor（m/z）Product（m/z）Collision Energy（V）RF Lens（V）RT/min孔雀石绿329208331684.27313*34隐性孔雀石绿331239*281514.2731631孔雀石绿-d5334318*371574.25隐性孔雀石绿-d633724029.81394.25322.2*19.9结晶紫372251411344.21356*43隐性结晶紫374238361574.22358*35三、试验步骤3.1样本提取称取5.00 g已捣碎的虾肉于50 mL离心管中，加入400 μL混合内标溶液（孔雀石绿-d5和隐性孔雀石绿-d6）。加入11 mL乙腈，超声波震荡提取2.0 min，2500 rpm涡旋震荡提取5.0 min，8000 r/min离心5.0 min，上清液转移至另一空50 mL离心管。重复提取一次，合并上清液，用乙腈定容至25 mL，摇匀待净化。3.2样本净化取Copure® 中性氧化铝柱（货号：COALN31000），加入5.0 mL乙腈活化。加入上述样品待净化液5.00 mL后再加入4.0 mL乙腈进行洗涤，合并收集全部过滤液，45℃水浴氮吹至近干。加入1.0 mL乙腈，超声震荡5.0 min，加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸铵，超声波震荡1.0 min，过0.22 μm滤膜后上机测试。3.3基质空白试验称取空白试样，按上述步骤进行实验。四、实验结果虾肉基质中结晶紫、隐形结晶紫、孔雀石绿及其内标、隐形孔雀石绿及其内标的定量离子对提取色谱图如下所示。虾肉中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标实验回收率结果详见表3，回收率90-110%之间，偏差值均小于5%，回收率和稳定性满足测试要求。表3 虾肉中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标回收率结果基质项目加标浓度（μg/kg）平均回收率(%)（n=3）RSD(%)（n=3）虾肉孔雀石绿8.0098.44.74隐性孔雀石绿8.0094.53.06结晶紫8.0093.12.97隐性结晶紫8.001063.29五、订购信息货号描述包装COALN31000Copure® 中性氧化铝柱，1g/3mL50支/盒SDC-3000-Dbiocomma® 多管涡旋混匀仪1台/箱BN2424孔智能氮吹仪1台/箱SF130-22-NL针式过滤器，尼龙，直径13mm，孔径0.22μm，有机系100个/盒SC2-12 mL蓝色聚丙烯盖，白色PTFE/红色硅胶垫，9-425100个/盒V2-AL2 mL螺纹棕色样品瓶，带书写处11.6*32 mm，9-425100个/盒虾肉中孔雀石绿和结晶紫残留量液相色谱-串联质谱法测定 (Copure@ ALN 中性氧化铝柱) 《GB /T 19857-2005水产品 中孔雀 石 绿 和 结晶紫 残 留量 测定 》 一、背景介绍 孔雀石绿和结晶紫是人工合成的三苯甲烷类化合物，都属于工业染料，因其价格低廉且 具有杀菌和驱虫的效果，曾广泛应用于水产养殖中，但孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的生物 毒性较强，在生物体内长期累积会对人体造成危害。 逗点生物结合自身产品优势，建立了固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法测定虾肉中的 孔雀石绿和结晶紫含量的方法，样品在提取后，经中性氧化铝柱固相萃取柱净化后，采用高 效液相色谱-串联质谱仪测定。经验证，加标回收率范围 90-110%， RSD值小于5%，满足要 求。 二、仪器条件 2.11色谱条件 仪器： UPLC-MS/MS (Thermo Fisher TSQ Endura) 色谱柱： Commasil Coreshell C18 (2.1 mm×100 mm， 1.7pm) 流动相： A-水(0.1%甲酸) B-乙腈(0.1%甲酸) 洗脱方式：梯度洗脱，见表1 表1流动相梯度洗脱条件 时间(min) 流速(mL/min) %B Curve 0.0 0.3 5 5 1.5 0.3 60 5 3.0 0.3 100 5 10.0 0.3 100 5 10.5 0.3 5 5 15 0.3 5 5 流速：0.3mL/min 柱温：30℃ 进样量：10pL 2.2质谱条件 离子源： HESI 电喷雾电压：3500V 鞘气压力：15 arb辅气压力：： 1arb 离子传输管：360℃辅气温度：380℃ 表2孔雀石绿和结晶紫离子对参数(*为定 量 离子) Compound Precursor(m/z) Product (m/z) Collision Energy(V) RF Lens (V) RT/min 孔雀石绿 329 208 33 168 4.27 313* 34 隐性孔雀石绿 331 239* 28 151 4.27 316 31 孔雀石绿-d5 334 318* 37 157 4.25 隐性孔雀石绿-d6 337 240 29.8 139 4.25 322.2* 19.9 结晶紫 372 251 41 134 4.21 356* 43 隐性结晶紫 374 238 36 157 4.22 358* 35 三、试验步骤 3.1样本提取 称取 5.00 g已捣碎的虾肉于 50mL离心管中，加入400 pL 混合内标溶液(孔雀石绿-d5和隐性孔雀石绿-d6)。加入 11 mL乙腈，超声波震荡提取 2.0 min， 2500 rpm 涡旋震荡提取 5.0 min， 8000 r/min 离心 5.0 min， 上清液转移至另 一 空 50 mL 离心管。重复提取 一 次，合 并上清液，用乙腈定容至25mL，摇匀待净化。 3.2样本净化 取 Copure@中性氧化铝柱(货号：COALN31000)， 加入5.0 mL 乙腈活化。加入上述 样品待净化液 5.00 mL 后再加入4.0 mL 乙腈进行洗涤，合并收集全部过滤液，45℃水浴氮 吹至近干。加入 1.0 mL乙， 超声震荡5.0 min， 加入1.0 mL 5 mmol/L 乙酸铵，超声波震 荡 1.0 min， 过 0.22 um 滤膜后上机测试。 3.3基质空白试验 称取空白试样，按上述步骤进行实验。 四、实验结果 虾肉基质中结晶紫、隐形结晶紫、孔雀石绿及其内标、隐形孔雀石绿及其内标的定量离 子对提取色谱图如下所示。 图1虾肉加标(8.0ug/kg ) 中隐性结晶紫 图2虾肉加标(8.0pg/kg)中结晶紫 SHUI HMr 图3虾肉加标(8.00ug/kg)中隐形孔雀石绿 图4虾肉加标(8.00 ug/kg) 中孔雀石绿 图5虾肉加标(8.00 ug/kg) 中孔雀 石 绿-d5 图6虾肉加标 (8.00ug/kg) 中 隐 形孔雀石绿-d6 虾肉中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标实验回收率结果详见表3，回收率90-110%之间，偏差值均小于5%，回收率和稳定性满足测试要求。 表3虾肉中孔雀石 绿 、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标回收率结果 基质 项目 加标浓度(ug/kg) 平均回收率(%)(n=3) RSD(%)(n=3) 虾肉 孔雀石绿 8.00 98.4 4.74 隐性孔雀石绿 8.00 94.5 3.06 结晶紫 8.00 93.1 2.97 隐性结晶紫 8.00 106 3.29 五、订购信息 货号 描述 包装 COALN31000 Copure@中性氧化铝柱， 1g/3mL 50支/盒 SDC-3000-D biocomma@多管涡旋混匀仪 1台/箱 BN24 24孔智能氮吹仪 1台/箱 SF130-22-NL 针式过滤器，尼龙，直径13mm， 孔径0.22um， 有机系 100个/盒 SC2-1 2 mL 蓝色聚丙烯盖，白色 PTFE/红色硅胶垫， 9-425 100个/盒 V2-AL 2 mL 螺纹棕色样品瓶，带书写处 11.6*32 mm， 9-425 100个/盒