贝类中毒素检测方案(固相萃取仪)

贝类中脂溶性贝类毒素的测定 2015-12-29 摘要：建立了测定贝类中大田软海绵酸（OA）、鳍藻毒素（DTX1、DTX2）、紫贻贝毒素（YTX）、原多甲藻酸贝毒素（AZA1）、螺环内酯毒素（SPX1）6种脂溶性贝类毒素的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱方法。该方法选择性、灵敏性和准确度高，6种脂溶性贝类毒素的定量限均在1ug/kg以下能满足实验室检测的技术要求，适用于贝类产品中脂溶性贝类毒素的确证及定量分析。 1 样品前处理 称取1g匀浆后的贝类组织样品于15ml聚丙烯离心管中，加入4.0ml 80%甲醇提取液淋洗，旋涡振荡2min，超声提取5min，4℃ 8000r/min离心5min，分离出上清液。重复上述操作一次，合并上清液。40℃氮吹浓缩至近1ml，加入1ml 水涡旋混匀，待净化。 依次用2ml甲醇、2ml 30%甲醇-水溶液活化StraraTM-X小柱,全量加入上样液。再用 1ml甲醇水溶液淋洗，最后用 4ml 30%氨水甲醇溶液（2:2 ，V:V）分两次洗脱。 洗脱液于40℃氮气吹干。准确加入 1ml甲醇，漩涡1min，装入3000MW离心超滤管中，4℃ 13000r/min离心10min。过0.22um PVDF后上机测定。 2 天津恒奥可提供的设备 氮吹仪 氮吹仪是浓缩的重要手段之一，通过氮气吹扫可以蒸发残余液体同时对液体进行保护，防止样品被空气氧化。HAC系列自动氮吹仪打破了传统氮吹仪模式，整个过程采用自动化设置，除克服传统氮吹仪的缺点，还采用光导纤维传感器增加自动浓缩关断功能，节省了大量人力和时间。 HAC-24 主要特点  1.最多可选同步浓缩24个样品； 2.各路均可以电磁阀、阀堵控制开通路数；      3.氮气流量、压力可调并实时显示；      4.透明窗可视样品的浓缩过程；      5.使用PTC加热元件，水浴均匀且运行可靠；      6.试管支品种多，适用各种试管尺寸；      7.带有气体排除设计，通过软管道排除水蒸气及被蒸发的液体；   8.HAC-24A选用先进的光导纤维传感器控制样品1mL、0.5mL自动关断并报警； 9.数显定时，报警提醒，无需工作人员看管 固相萃取装置 数控固相萃取仪完全支持固相萃取操作的每个步骤。其基本原理是利用数控泵的技术，各小柱接头可独立提供相对恒定的负压 让各种溶液按标准分析程序要求的流速通过小柱，确保目标分析物质的高效萃取，最后将小柱转换到洗脱架上，正压匀速洗脱，避免交叉污染。 HSE-08A 主要特点 1.精确控速，单道流速0.1-7ml/min，支持大体积进样和正压洗脱； 2.无级数控操作、LED数字显示调节转速确定流速，具有定时功能； 3.多通道，小柱接头才用四氟乙烯材质均耐酸、碱、有机溶剂、氧化剂腐蚀； 4.操作简单，单人操作可同时进行1-8个样品的处理，大大提高工作效率； 5.密封性好，稳定性强，转速与流速呈良好线性关系； 6.数显定时，保证抽取液体体积的准确性。 7.采用蠕动泵吸取液体，无需外加真空泵等设备。 恒奥可提供的其他型号的固相萃取仪 3 标准溶液制备 贝类毒素单标储备液（0.31-1.51ug/ml）；准确吸取适量OA、DTX2、YTX、DTX1、AZA1及SPX1，用甲醇稀释并定容至10ml，分别配成OA（1.37 ug/ml）、DTX2（0.78 ug/ml）、YTX(0.55ug/ml)、DTX1(1.51 ug/ml)、AZA1(0.31 ug/ml)及SPX1（0.70 ug/ml）的单标储备液，-18℃避光保存；贝类毒素混合标准中间溶液（31-151ug/L）：准确吸取贝类毒素单标储备液（0.31-1.51 ug/ml）各0.10 ml，用甲醇稀释定容至10 ml，配成浓度范围在31-151 ug/L的标准中间液。 4 仪器条件 色谱条件：采用 Water XTerra @ MS C18质谱柱(150mm×2.1mm，3.5um )，流动相A为乙腈-水（90:10，V/V；含6.7 mmol/L氨水）流动相B为水(含6.7 mmol/L氨水)，流速0.20ml/min，柱温40℃，进样量10 ul，流动相梯度洗脱程序见表1。 质谱条件：正离子电喷雾模式，毛细管电压3.5kV，负离子电喷雾模式，毛细管电压3.0kV，萃取电压3.0 V，射频透镜电压0.4 V，离子源温度120℃，去溶剂气温度350℃，去溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h，碰撞室压力（Ar）3.99×10-4 Pa，采用多反应检测模式（MRM）检测，ESI+采集时间为5.0-8.0 min，ESI-采集时间为8.0-12.0 min。 5 空白基质加标的工作曲线绘制 称取一组阴性的扇贝组织空白基质样品各 1g，向其中分别添加贝类毒素混合标准中间溶液12.5、25.0、100.0、200.0、400.0及600 ul配制不同浓度系列的工作曲线浓度。以下操作分别按样品前处理步骤进行提取净化前处理并依次上机测定，以待测物的峰面积为纵坐标，对应空白基质中的标准液质量浓度为横坐标，绘制工作曲线。 该法采用 SPE与离心超滤管离心相结合，能最大程度地消除基质干扰；采用空白基质加标工作曲线定量，能有效地补偿基质直接加标外标法所带来的目标物非线性损失。通过以上措施，很好地消除了共流出组分对离子化效率的抑制，提高了定量的灵敏度和准确度。方法的回收率和重现性等方法学指标均能满足痕量贝类毒素的检测要求；同时本法采用高效分离、双离子监控模式，可准确地甄别样品中的目标组分，适用于贝类产品中6种脂溶性贝类毒素的确证及定量分析。 2