检测样品:干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)检测项目:片段化合物筛选应用领域: 制药方案摘要:由NanoTemper和药明康德子公司Crelux合作完成的STING抑制剂片段筛选案例。包括阳性化合物TSA实验验证STING蛋白结合活性,片段化合物单点筛选及亲和力排序实验。方案详情: 干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)在天然免疫中发挥重要作用,当细胞被病原体(如病毒)感染时,STING可以诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生,是靶向治疗自身免疫疾病和癌症的潜在靶标蛋白。近年STING相关研究火爆,管线数量激增。目前全球范围内在研的STING靶向药物超过50种。今天给大家介绍的STING抑制剂片段筛选案例是由NanoTemper和药明康德旗下的Crelux公司合作完成的。研究人员生产纯化了带有His-tag的STING蛋白,随后使用Prometheus蛋白稳定性分析仪进行缓冲液优化并使用环二核苷酸cGAMP作为阳性对照进行Thermal shift assay,快速验证了蛋白的结合活性。参考文章“差示扫描荧光法表征蛋白配体互作,不加染料的那种“。接下来研究人员使用Dianthus完成了片段化合物库单点筛选及亲和力排序。在使用Dianthus进行筛选时,其中一个分子需要带有荧光。本实验中研究人员使用His-tag荧光标记试剂盒对STING蛋白进行了特异性标记,片段终浓度为500μM,结合缓冲液为50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, 0.005% TWEEN® 20, 4% DMSO。STING片段筛选流程 下图为单点筛选结果,2213个片段加上阳性及DMSO对照(均重复一次)总共采集了5376个数据点,即14块384孔板。消耗590μg STING蛋白,上机检测时间约8h(Dianthus 33min即可完成一块384孔板检测)。紫色线框中的黄色数据点为阳性对照cGAMP,213个阳性化合物响应值CV仅0.25%,检测重复性非常好。最后将单点筛选结果中的162个hits(上图蓝色数据点)进行12个浓度点的梯度稀释检测亲和力。消耗STING蛋白190μg,上机检测时间约3h。苗头化合物验证基于片段的药物发现 (FBDD) 是药物研发的主流方法之一。但片段分子量低,且与蛋白靶标亲和力低,通常在μM-mM范围,因此对筛选技术的灵敏度有较高的要求。Dianthus基于光谱位移技术(Spectral shift)检测,不依赖于分子量,可检测pM-mM的亲和力。此外,Dianthus检测一个kd仅需1min,单孔上样体积20μl,是您亲和力筛选项目的强大工具!