中药中赭曲霉毒素A检测方案(固相萃取仪)

LabTech 2020版《中国药典》2351中药赭曲霉毒素A测定解决方案 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 前言 随着我国中医药产业的快速发展，中药材与饮片使用人群范围日益扩大，市场需求不断增长。 由于产地分布广、加工企业多、制备工艺各异及成分复杂多变等，给中药材与饮片的质量控制带来极大的挑战，保障中药材与饮片安全性显得尤为重要。因此，中药材与饮片微生物污染 问题不容忽视，特别是在生产以及加工储运过程中，如不采取有效措施加以控制，极易造成外源微生物的污染，其中可能产生大量致病菌和某些真菌毒素，导致中药材与饮片存在一定的安全性风险隐患，给临床使用带来安全性问题。 赭曲霉毒素是最常见的天然毒素之一，它是由赭曲霉和硫色曲霉产生的代谢产物，共有4种类型，其中赭曲霉毒素A的毒性最大且产毒量最高。赭曲霉毒素A具有肾毒性、神经毒性、免疫抑制等，大剂量使用才能引起肝病变，因此它被国际癌症研究组织列为2B类致癌物质。目前研究表明赭曲霉毒素A不仅在粮食中存在污染，其对中药材的污染也有报道。 本文参考2020版《中国药典》23511通则中的赭曲霉毒素A测定法，使用LabTech SPE 1000 全自动固相萃取系统对常用中药(人参、枸杞、大枣)的赭曲霉毒素A进行富集净化，采用 LC-MS检测，建立了一套中药的赭曲霉毒素A处理检测方法，采用免疫亲和柱净化样品，此方法回收率及平行性良好，标准曲线R2>0.99，加标回收率为92.0%~95.5%，重复性 RSD 为 1.6%~2.7%，满足检测要求。 ( 北京莱伯泰科仪器有限公司 ) ( 电 话 ：0 10-8 04 8 645 0(总 部)/ 64 97 3 11 9 (市 场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 关键词： SPE 10002020版《中国药典》 赭曲霉毒素A2351通则MiniLab3000 1仪器设备及试剂 1.11仪器设备 1.1.1 SPE 1000 全自动固相萃取系统(莱伯泰科公司)； 1.1.2 SCIEX Exion LC液相系统+ Triple QuadM 4500质谱系统(SCIEX中国公司)； 1.1.3 MiniLab3000 全自动液体样品处理平台(莱伯泰科公司)； 1.2试剂及耗材 1.2.1甲醇(色谱级)； 1.2.2蒸馏水； 1.2.3 赭曲霉毒素免疫亲和柱(3mL， Beacon)： 1.2.4赭曲霉毒素A标品溶液(购自坛墨质检)； 1.2.5氯化钠； 1.2.6淋洗缓冲液(5g NaHCO3， 25g NaCl， 0.1mL吐温-20，用水稀释至1000mL)： 2试验方法 2.11样品处理 分别取人参、枸杞、大枣三种中药进行实验，取供试品粉末约5g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠1g，，精密加入80%甲醇溶液25 mL， 均质 2min ( 北京莱伯泰科仪器有限公司 ) (11000r/min)，离心 10min(4000r/min)，取上清液5mL，用水稀释至25mL，离心10min (4000r/min)，取上清液 10mL 作为后续实验样品。 2.2免疫亲和柱净化 将2.1的10mL样品放入 SPE 1000全自动固相萃取系统，按照图1所示的方法进行样品的净化步骤，收集净化液，用0.22um滤膜过滤，待后续处理。 图1赭曲霉毒素A净化流程 2.33基质加标回收率实验 标准曲线配制：取对照品母液至 MiniLab3000 全自动液体样品处理平台上，按图2方法配制标曲。 北京莱伯泰科仪器有限公司 ( 电 话 ： 01 0-80 48 6 450 (总部 )/6 49 73 1 19 ( 市场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 图2 MiniLab3000 全自动液体样品处理平台赭曲霉毒素A标曲配制流程 按2.1方法准备样品，进行加标实验，按药典所规定的定量限 1ug/kg 进行加标，，然后按照2.2方法进行前处理实验，同时进行3个平行样品，用来测定加标回收率及平行性。 2.4 LC-MS分析条件 2.4.1液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (2.7um， 2.1*100mm)； 流动相： A：0.1%甲酸溶液；B：甲醇； 流速： 0.3mL/min；柱温：40℃；进样量： 5pL； 洗脱梯度： 0min， 55%B； 5min， 90%B；7min， 90%B； 7.1min， 55%B；10min， 55%B： 2.4.2质谱条件 离子源： ESI源， MRM模式，负离子模式； 北京莱伯泰科仪器有限公司 ( 电 话 ： 01 0-80 48 6 450 (总部 )/6 49 73 1 19 ( 市场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 离子源参数： IS电压：-4500V 气帘气 CUR：35 psi； 雾化气 GS1：55 psi 辅助气 GS2：60 psi； 源温度 TEM：550℃ 碰撞气 CAD： 9 psi； 3结果和讨论 3.1各样品色谱图 图3标准工作液 LC-MS MRM 总离子流色谱图(正离子模式) 北京莱伯泰科仪器有限公司 ( 电 话 ： 01 0-80 48 6 450 (总部 )/6 49 73 1 19 ( 市场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 图4基质加标 LC-MS MRM 总离子流色谱图(正离子模式) 3.2标准曲线 按2.3中的配制的对照品溶液计算得出标曲(以相对峰面积和浓度作标准曲线)的线性方程、相关系数，见图5。 ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) Calibration for OA：y=3.15303e5x+3146.98025 (r=0.99656，r=0.99314) (weighting：1/x^2) 图5赭曲霉毒素A标准曲线 3.2加标回收率 加标样品经免疫亲和柱净化后，分别进行 LC-MS分析、定量，计算得到的加标回收率及相对标准偏差如表1所所。 表1赭曲霉毒素A加标回收率 中药品种 回收率(%) 平均值(%) RSD 1 2 3 枸杞 93.2% 92.2% 95.1% 93.5% 1.6% 人参 91.8% 90.1% 94.2% 92.0% 2.3% 大枣 98.2% 95.2% 93.0% 95.5% 2.7% 4结论 由图5、表2可知，2020版《中国药典》2351通则中赭曲霉毒素A测定法的标准曲线 R2>0.99，加标回收率为 92.0%~95.5%，重复性 RSD 为 1.6%~2.7%，满足检测要求。 ( 北京莱伯泰科仪器有限公司 ) ( 电 话 ： 01 0-80 48 6 450 (总部 )/6 49 73 1 19 ( 市场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 综上所述，莱伯泰科SPE 1000 全自动固相萃取系统及 MiniLab3000 全自动液体样品处理平台能够高效、稳定地达到实验的要求，适用于2020版《中国药典》2351通则中规定的赭曲霉毒素A测定，适用于人参、大枣、枸杞等多种中药样品的前处理实验。 ( 参考文献： ) ( [1]刘蕊，赵新悦，毛雯雯，冯红，王亚东，张东浩，张兰兰.中药材中黄曲霉毒素及赭曲霉毒 素A污染的研究进展[].中国药物警戒，2020，17(02)：117-120+128. ) ( [2 ] 中华人民共和国药典2020年版.四部[S].2020： 30ChP 2020. Vol Ⅳ [ S].2020： 30. ) 撰稿人：QSY 北京莱伯泰科仪器有限公司 ( 电 话 ： 01 0-80 48 6 450 (总部 )/6 49 73 1 19 ( 市场 ) ) ( 传真：01 0-8 0 4 86354( 总 部)/64 97 4 268 ( 市场) ) 地址：北京空港工业区Your Lab， Our Techwww.labtechgroup.com 地址：北京空港工业区电话：总部)/市场)Your Lab， Our Tech传真：总部)/市场)www.labtechgroup.com 随着我国中医药产业的快速发展，中药材与饮片使用人群范围日益扩大，市场需求不断增长。由于产地分布广、加工企业多、制备工艺各异及成分复杂多变等，给中药材与饮片的质量控制带来极大的挑战，保障中药材与饮片安全性显得尤为重要。因此，中药材与饮片微生物污染问题不容忽视，特别是在生产以及加工储运过程中，如不采取有效措施加以控制，极易造成外源微生物的污染，其中可能产生大量致病菌和某些真菌毒素，导致中药材与饮片存在一定的安全性风险隐患，给临床使用带来安全性问题。赭曲霉毒素是最常见的天然毒素之一，它是由赭曲霉和硫色曲霉产生的代谢产物，共有4种类型，其中赭曲霉毒素A的毒性大且产毒量高。赭曲霉毒素A具有肾毒性、神经毒性、免疫抑制等，大剂量使用才能引起肝病变，因此它被国际癌症研究组织列为2B类致癌物质。目前研究表明赭曲霉毒素A不仅在粮食中存在污染，其对中药材的污染也有报道。本文参考2020版《中国药典》2351 通则中的赭曲霉毒素A测定法，使用LabTech SPE 1000全自动固相萃取系统对常用中药（人参、枸杞、大枣）的赭曲霉毒素A进行富集净化，采用LC-MS检测，建立了一套中药的赭曲霉毒素A处理检测方法，采用免疫亲和柱净化样品，此方法回收率及平行性良好，标准曲线R2>0.99，加标回收率为92.0%~95.5%，重复性RSD为1.6%~2.7%，满足检测要求。关键词：SPE 1000 2020版《中国药典》 赭曲霉毒素A  2351通则  MiniLab3000