中药中黄曲霉毒素检测方案(固相萃取仪)

北京莱伯泰科仪器股份有限公司Beijing LabTech Instruments Co.， Ltd 2020版《中国药典》2351中药黄曲霉毒素测定解决方案 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 前言 随着我国中医药产业的快速发展，中药材与饮片使用人群范围日益扩大，市场需求不断增长由于产地分布广、加工企业多、制备工艺各异及成分复杂多变等，给中药材与饮片的质量控制带来极大的挑战，保障中药材与饮片安全性显得尤 为重要。因此，中药材与饮片微生物污染问题不容忽视，特别是在生产以及加工储运过程中，如不采取有效措施加以控制，极易造成外源微生物的污染，其中可能产生大量致病菌和某些真菌毒素，导致中药材与饮片存在一定的安全性风险隐患，给临床使用带来安全性问题。 黄曲霉毒素具有很强的肝毒性和致癌性，可致人死亡。，中药材在其种植、采收、运输和贮藏过程中，每个环节都可能因为操作方法不当而被黄曲霉毒素污染，从而导致大量黄曲霉毒素的生长和积累，这将直接影响中药的质量与疗效，极大地危害着人们的身体健康，并且使中药的质量与使用安全得到了限制。 本文参考2020版《中国药典》2351通则中的黄曲霉毒素测定法，使用莱伯泰科 SPE1000 全自动固相萃取系统对常用中药(人参、枸杞、大枣)的黄曲霉毒素进行固相萃取，采用 LC-MS 检测，建立了一套中药的黄曲霉毒素处理检测方法，采用免疫亲和柱柱净化样品，此方法回收率及平行性良好，各成分加标回收率为65.0%~103.3%，，重复性 RSD 为 1.2%~4.3%，满足检测要求。 关键词：SPE10002020版《中国药典》黄曲霉毒素 2351通则 MiniLab3000 一、仪器设备及试剂 (一))仪器设备 SPE1000全自动固相萃取系统(莱伯泰科公司)； SCIEX Exion LCTM液相系统+Triple Quad TM 4500 质谱系统 (SCIEX中国公司)； MiniLab3000全自动液体样品处理平台(莱伯泰科公司)； (二)试剂及耗材 甲醇(色谱级)；蒸馏水；黄曲霉毒素免疫亲和柱(3mL，Romer)：黄曲霉毒素混标溶液(购自坛墨质检)； 氯化钠； PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCI 1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4，溶于 800ml蒸馏水中，用HCI 调节溶液的 pH值至7.4后，稀释至1000mL)； 二、试验方法 (一)样品处理 分别取人参、枸杞、大枣三种中药进行实验，精密称取各中药样品粉末15g，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75mL， 均质 2min (11000r/min)，)，离心5min (每分钟4000转)，取上清液15mL，用水稀释至50mL， 离心10min(每分钟4000转)混匀，取上清液20mL 作为后续实验样品。 (二)免疫亲和柱净化 将2.1的20mL样品放入 SPE1000 全自动固相萃取系统，按照图1所示的方法进行样品的净化步骤，收集净化液，用0.22um滤膜过滤，待后续处处。 图1黄曲霉毒素净化流程 (三)基质加标回收率实验 标准曲线配制：取混标母液至MiniLab3000 全自动液体样品处理平台上，按图2方法配制标曲，最终各成分浓度如表1。 图2 MiniLab3000全自动液体样品处理平台黄曲霉毒素标曲配制流程 表1混合对照品浓度表 化合物 浓度(ng/mL) 黄曲霉毒素B1 0.1 0.5 1 5 10 黄曲霉毒素B2 0.05 0.1 0.5 1 5 黄曲霉毒素 G1 0.1 0.5 1 5 10 黄曲霉毒素 G2 0.05 0.1 0.5 1 5 按2.1方法准备样品，进行加标实验，按药典所规定的检出限黄曲霉毒素B1、 G1 0.5ug/kg， 黄曲霉毒素B2、G2 0.2ug/kg 进行加标，然后按照2.2方法进行前处理实验，同时进行3个平行样品，用来测定加标回收率及平行性。 (四)LC-MS分析条件 1、液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (2.7pm， 2.1*100mm)； 流动相： A： 10mmol/L 乙酸铵溶液；B：甲醇； 流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：5pL； 洗脱梯度： 0min， 35%B； 4.5min， 85%B； 6min， 100%B； 6.5min， 35%B；10min， 35%B； 2、质谱条件 离子源：ESI源，MRM模式，正离子模式； 离子源参数： IS电压：5500V 气帘气 CUR：35 psi；雾化气 GS1：50 psi 辅助气 GS2：65 psi；源温度 TEM：650℃ 碰撞气 CAD： 8 psi； 三、结果和讨论 (一)各样品色谱图 图3标准工作液 LC-MS MRM 总离子流色谱图(正离子模式) 图4基质加标LC-MS MRM 总离子流色谱图(正离子模式) (二)标准曲线 按2.3中的配制的混标溶液计算得出各组分(以相对峰面积和浓度作标准曲线)的线性方程、相关系数，见图5. Calibration for AB1：y=9.51918e4x+-2685.87890 (r=0.99977，r=0.99954) (weighting：None) 图5多黄曲霉毒素菌毒素 LC-MS 法标准曲线 (三)加标回收率 加标样品经免疫亲和柱净化后，分别进行 LC-MS分析、定量，计算得到的加标回收率及相对标准偏差如表3所示。 表3多种真菌毒素 LC-MS 法加标回收率 中药品种 物质名称 回收率(%) 平均值(%) RSD 1 2 3 黄曲霉毒素B1 94.4% 96.0% 92.1% 94.2% 2.1% 人参 黄曲霉毒素B2 94.7% 95.6% 93.3% 94.5% 1.2% 黄曲霉毒素G1 98.1% 95.2% 92.3% 95.2% 3.0% 黄曲霉毒素G2 86.1% 85.1% 82.0% 84.4% 2.5% 黄曲霉毒素B1 93.3% 94.0% 91.0% 92.8% 1.7% 大枣 黄曲霉毒素B2 80.9% 87.9% 83.0% 83.9% 4.3% 黄曲霉毒素G1 94.7% 93.9% 90.0% 92.9% 2.7% 黄曲霉毒素 G2 64.2% 62.8% 68.0% 65.0% 4.1% 枸杞 黄曲霉毒素B1 105.0% 106.0% 99.0% 103.3% 3.7% 黄曲霉毒素B2 103.0% 105.0% 102.0% 103.3% 1.5% 黄曲霉毒素G1 101.0% 105.0% 101.0% 102.3% 2.3% 黄曲霉毒素 G2 103.0% 100.0% 95.1% 99.4% 4.0% 四、结论 由表3可知，2020版《中国药典》2351 通则中黄曲霉毒素测定法的加标回收率为65.0%~103.3%，重复性 RSD 为1.2%~4.3%，满足检测要求。 综上所述，莱伯泰科SPE1000 全自动固相萃取系统及 MiniLab3000 全自动液体样品处理平台能够高效、稳定地达到实验的要求，适用于2020版《中国药典》2351通则中规定的黄曲霉毒素测定，适用于人参、大枣、枸杞等多种中药样品的前处理实验。 ( 参考文献： ) ( [1] 张晓萍，刘笑笑，苗菊.中药中黄曲霉毒素的研究进展[J].甘肃科 技，2021，37(05)：73-77. ) ( [2]柯颖，徐昕怡，洪小栩.ELISA 法检测中药材及中药饮片真菌毒素的探讨[J].中国合理 用药探索，2020，17(04)：17-21. ) 前言：  随着我国中医药产业的快速发展，中药材与饮片使用人群范围日益扩大，市场需求不断增长。 由于产地分布广、加工企业多、制备工艺各异及成分复杂多变等，给中药材与饮片的质量控制带来极大的挑战，保障中药材与饮片安全性显得尤为重要。因此，中药材与饮片微生物污染问题不容忽视，特别是在生产以及加工储运过程中，如不采取有效措施加以控制，极易造成外源微生物的污染，其中可能产生大量致病菌和某些真菌毒素，导致中药材与饮片存在一定的安全性风险隐患，给临床使用带来安全性问题。  黄曲霉毒素具有很强的肝毒性和致癌性，可致人死亡。中药材在其种植、采收、运输和贮藏过程中，每个环节都可能因为操作方法不当而被黄曲霉毒素污染，从而导致大量黄曲霉毒素的生长和积累，这将直接影响中药的质量与疗效，极大地危害着人们的身体健康，并且使中药的质量与使用安全得到了限制。  本文参考2020版《中国药典》2351 通则中的黄曲霉毒素测定法，使用莱伯泰科SPE1000全自动固相萃取系统对常用中药（人参、枸杞、大枣）的黄曲霉毒素进行固相萃取，采用LC-MS检测，建立了一套中药的黄曲霉毒素处理检测方法，采用免疫亲和柱柱净化样品，此方法回收率及平行性良好，各成分加标回收率为65.0%~103.3%，重复性RSD为1.2%~4.3 %，满足检测要求。关键词：  SPE1000  2020版《中国药典》 黄曲霉毒素  2351通则  MiniLab3000