中药样品中黄曲霉毒素B族和G族检测方案(液相色谱仪)

华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪 S6000 测定中药中黄曲霉毒素B族和G族 应用优势 1) 各组分分离度良好 2) 方法回收率良好 3) 检测限度远低于药典要求 前言 作为真菌毒素重要代表的黄曲霉毒素，是至今为止发现的毒性最大的真菌毒素，是世界公认的3大强致癌物质之一，它对肝脏影响最大，并有致畸、致突变、致癌的风险。近年来随着中药材应用量的攀增，研究人员在陈皮、杏仁、黄芪、地龙等多种中药材中发现了黄曲霉毒素污染超标的现象，将有可能对使用安全造成威胁。目前中药中黄曲霉毒素B族和G族的检测的国家现行标准为2020版药典，覆盖了大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁等多种中药，实现了黄曲霉毒素B族和G族的检测。其中，黄曲霉毒素B1和 G1本来具有较强的荧光性，但接触水以后，发生荧光的淬灭现象，荧光性基本消失，很难用液相色谱检测出来，所以必须采用衍生的方法使黄曲霉毒素B1和G1的荧光性增强，才能满足国际和国内各项检测标准的要求。目前药典规定的衍生方法碘衍生法和光化学衍生法。其中，光化学衍生法不需要任何化学试剂，直接将光化学衍生器连接在色谱柱与荧光检测器之间，操作简单，检测结果准确，灵敏度高。本项目按照药典中光衍生方法实现中药中黄曲霉毒素B族和G族的检测。 实验部分 样品的制备 取供试品粉末 7.5 g于 50 mL的离心管中，加入1.5g氯化钠，精密加入70%甲醇37.5mL，涡旋混匀，置于涡旋振荡器中最高速振荡2 min， 在4000 r/min 下离心5 min， 取上清液备用；准确移取 15 mL上述上清液，置于50mL离心管中，加入35mL的水，混匀，在4000 r/min 下离心10 min， 取上清液备用；将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，免疫亲和柱内的液体放弃后，准确量取上述样液15 mL 于 40 mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以 3mL/min 的速度稳定下滴，待样液滴完后，往注射器筒内加入20 mL 的水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱，脱离真空系统，在亲和 柱下部放置 10 mL 刻度试管，取下40mL 的注射器筒， 2×1mL 甲醇洗脱亲和柱，收集全部洗脱液至试管中，涡旋混合，0.22 u m 滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。 仪器配置与分析方法 液相条件 仪器配置 Acchrom S6000 组织器 S6110 四元泵 S6210进样器 S6310 柱温箱 S6440 荧光检测器柱后光衍生器 色谱柱 Tnature C18， 4.6 mm*250 mm， 5 um 流动相 A： 甲醇；B：乙青；C水 流速 1ml/min 进样量 25pl 柱温 25°℃ 检测波长 激发文长：360nm，检测波长：450mn 结果与讨论 实际样品的测定 图1-2为实际样品通过免疫亲和柱前处理后在上述条件下的分离结果。本实验选择薏苡仁、全蝎、僵蚕、陈皮、槟榔、麦芽和桃仁作为实际样品进行检测，由图中结果显示，中药样品基质不干扰黄曲霉毒素出峰。本实验采用单点校正法测定样品含量，黄曲霉毒素各组分浓度均为 0.6 ng/mL， 样品中黄曲霉毒素各组分含量见表1，除僵蚕样品检测出黄曲霉毒素B1组分，其余样品黄曲霉毒素均未检出。 图1黄曲霉毒素标准品与实际样品色谱图 1.00- 分钟 图2实际样品色谱图 表11中药样品中黄曲霉毒素含量表 名 薏苡仁 全蝎 僵蚕 陈皮 槟榔 麦芽 桃仁 称 (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) B2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 B1 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 G2 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 G1 未检出 未检出 0.09 未检出 未检出 未检出 未检出 线性、检测限、定量限 按照2020版《中国药典》要求，分别取黄曲霉毒素混合对照品溶液 5、10、15、20、25uL进样，得到各黄曲霉毒素标准曲线(见图3)，其线性相关系数均大于 0.9999。以 S/N=3为检测限， S/N=10为定量限，测定黄曲霉毒素四个组分的检测限和定量限，由表2结论可知，黄曲霉毒素各峰检测限和定量限均低于符合药典要求黄曲霉毒素的检测限。 图3黄曲霉毒素标准曲线图 表2黄曲霉毒素的线性、检测限和定量限 名称 检测限 定量限 G2 0.01 ug/kg 0.04 ug/kg G1 0.04 ug/kg 0.1 ug/kg B2 0.01 ug/kg 0.04 ug/kg B1 0.04 ug/kg 0.1 ug/kg 加标回收率 通过加标回收实验来验证方法准确度，加标回收率如表3所示。结果表明黄曲霉毒素各 峰均有良好的回收率， RSD%符合国标要求。 表3：加标回收结果数据表(n=3，单点外标法) 名称 加标量(ppb) 回收率 RSD(%) 1 98% 5.8 G2 5 91.2% 0.9 10 103% 6.7 1 93% 2.7 G1 5 98.2% 2.6 10 104% 5.9 1 101% 5.8 B2 5 93.2% 0.5 10 107% 6 1 97% 3.2 B1 5 94.6% 0.7 10 104% 5.8 结论 中药中黄曲霉毒素的检测在中药行业中是行业热点，也是重点。本项目按照药典中光衍生方法实现中药中黄曲霉毒素B族和G族的检测。此外由于市场上有的免疫亲和柱质量不佳，回收率不合格，所以我们对该方法进行了验证，结果表明加标回收均良好，符合药典要求。从结果看该方法检测限和定量限均很低，表明我们荧光检测器具有高的灵敏度。 联系我们 关注我们 www.acchrom-tech.com 华谱科仪(北京)科技有限公司热线电话：010-8410-9313 邮箱： marketing@acchrom-tech.com 中药样品基质不干扰黄曲霉毒素出峰，分别取黄曲霉毒素混合对照品溶液5、10、15、20、25 μL进样，得到各黄曲霉毒素标准曲线，其线性相关系数均大于0.9999。以S/N=3为检测限，S/N=10为定量限，测定黄曲霉毒素四个组分的检测限和定量限，黄曲霉毒素各峰检测限和定量限均低于药典要求黄曲霉毒素的检测限。