水产品中青霉素类药物多残留检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-008Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-610 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMSMS 法分析水产品中青霉素类药物多残留 LCMSMS-610 摘要：本文利用岛津三重四四杆液质联用仪建立了水产品中11种青霉素类抗生素残留量的测定方法。样品经乙腈水提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。结果显示该方法在 2~300 ng/mL浓度范围内建立标准曲线，线性相关系数均大于0.999，线性良好；精密度考察中各物质保留时间RSD分布在0.02%~0.04%，峰面积 RSD 分布在 0.83%~4.41%之间；11种青霉素类抗生素物质的灵敏度检出限在 0.001~0.49 ug/kg 之间，定量限在 0.003~1.64 ug/kg 之间，表明仪器灵敏度良好。该方法分析速度快，灵敏度高，准确度好适用于鱼虾等水产品中11种青霉素类抗生素的含量测定，也可为相关从业人员分析检测提供参考。 关键词：三重四极杆液相色谱质谱联用仪水产品 青霉素类抗生素 青霉素类抗生素因结构含有β内酰胺环，也称β内酰胺类抗生素。青霉素是第一种应用于人类疾病治疗的抗生素，弗莱明教授也因为发现青霉素而获得1945年诺贝尔奖。常见的青霉素类药物包括青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林等，除青霉素G外，属于部分合成抗生素。青霉素价格低廉、抗菌性强，在水产养殖上被广泛用于鱼、虾细菌感染的治疗。此类抗生素的不合理使用，为食品安全带来隐患。GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，在鱼虾中青霉素G、阿莫西林、氨苄西林残留限量(MRLs) 50 ug/kg， 氯唑西林、苯唑西林 MRLs 300 ug/kg。 此前， GB/T 22952-2008《河豚鱼和鳗鱼中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、 苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林残留量的测定液相色谱-串联质谱法》规定了河豚鱼和鳗鱼中9种青霉素类化合物残留的测定方法。近期， 《水产品中青霉素类药物多残留的测定液相色谱-串联质谱法(报批稿)》对 GB/T 22952-2008标准进行了更新，修改了标准适用范围，增加了阿洛西林和甲氧西林，并增加了固相萃取和超滤管离心的净化步骤，修改了方法的检出限和定量限。 本文采用岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪，参照《水产品中青霉素类药物多残留的测定液相色谱-串联质谱法(报批稿)》，建立了水产品中11种青霉素类抗生素残留的检测方法。该方法快速、准确、灵敏度高，可以用于水产品中青霉素类抗生素药物的筛查和准确测定。 实验部分 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为： 输液泵： LC-20ADx×2 系统控制器： CBM-20A自动进样器：SIL-30ACMP三重四极杆质谱仪： LCMS-8045柱温箱： CTO-20AC色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.97 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST (100 mmx 2.1 mm l.D.，2 um)，SGLC，P/N：227-30001-04 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-乙腈 流速：0.3mL/min 进样量：1uL 柱温：40℃洗针模式：RO，甲醇/水=1：1 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps PumpB Conc. 2 7.00 Pumps Pump B Conc. 100 10.00 Pumps Pump B Conc. 100 10.10 Pumps Pump B Conc. 2 12.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪： LCMS-8045 脱溶剂管温度：250℃ 离子源：ESI* 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10L/min 扫描模式：MRM 加热气：空气10L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 物质名称 保留时间 (min) 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) CE (V) 1 阿莫西林 4.12 366.0 208.0* -14 366.0 349.1 -10 2 氨苄西林 4.43 349.9 106.1* -19 350.0 192.0 -17 3 青霉素G 6.05 334.9 160.0 -12 335.0 176.1* -15 4 青霉素V 6.27 350.9 160.0* -12 350.9 192.0 -14 5 苯唑西林 6.43 401.9 243.1* -14 402.0 160.0 -13 6 氯唑西林 6.63 436.0 277.0* -15 436.0 160.0 -14 7 萘夫西林 6.72 415.0 199.0* -15 415.0 171.0 -39 8 双氯西林 6.91 469.9 311.0* -16 469.9 160.0 -16 9 哌拉西林 5.81 518.0 143.1* -20 518.0 160.0 -13 10 阿洛西林 5.51 462.0 218.1* -23 461.9 246.1 -13 11 甲氧西林 5.84 381.0 165.0* -20 381.0 222.0 -17 *定量离子对 1.3标准溶液制备 标准储备液的配制：分别精确称取表3中各组分标准品约1 mg至10mL容量瓶中，加入30%乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到0.1 mg/mL的各标准物储备液，-18℃避光，有效期5天。分别取适量各标准储备液于 10mL容量瓶中，用30%乙腈水溶液进行稀释定容，得到1 ug/mL混合标准中间液；再将混合标准中间液逐级稀释成浓度为2、5、20、50、200、300 ng/mL的标准工作曲线，待上机分析。 表3 青霉素类抗生素药物的化合物信息 序号 中文名称 英文名称 CAS# 分子式 1 阿莫西林 Amoxicilin 61336-70-7 C16H19N3O，S 2 氨苄西林 Ampicillin 7177-48-2 C16H19N3O4S 3 青霉素G Penicillin G 113-98-4 C16H17N204S 4 青霉素V Penicillin V 132-98-9 C16H17N20，S 5 苯唑西林 Oxacillin 7240-38-2 C19H19N3O，S 6 氯唑西林 Cloxacillin 7081-44-9 C19H20CIN3O，S 7 双氯西林 Dicloxacillin 13412-64-1 C19H17CINO，S 8 萘夫西林 Nafcillin 7177-50-6 C21H24N20，S 9 哌拉西林 Piperacillin 61477-96-1 C23H27N5O7S 10 阿洛西林 Azlocillin 37091-66-0 C20H23NsO，S 11 甲氧西林 Methicillin 7246-14-2 C17H23N20-S 1.4样品前处理 准确称取样品2.5 g，置于50mL离心管中，准确加入5 mL80% 乙提提取液，涡旋60s，分散均匀，超声提取 10 min， 再以8000 r/min 转速离心5 min，!吸取上清液于50mL 离心管中，加入4mL 80%乙腈提取液重复提取，合并上清，80%乙腈提取液稀释至10.0 mL，备用。取备用液2mL， 过 SHIMSEN Styra HLB (200mg/6 mL， P/N：5010-81976)固相萃取柱，氮吹至<0.5 mL， 加水至0.5 mL， 10 kDa 超滤管离心10 min， 待测。 结果与讨论 2.111种标准物质的 MRM色谱图 按照1.3配制的2ng/mL混合标准溶液，上机分析，得到11种青霉素类抗生素药物的MRM色谱图，详见图1，色谱峰形良好，通道无干扰。 图1111种青霉素类抗生素标准溶液的 MRM色谱图(2ng/mL) 2.2标准曲线线性范围 按照1.3方法配制标准系列溶液，上机分析得出各化合物的线性范围和线性关系，详见表4。11种青霉素类抗生素在 2~300 ng/mL范围内，线性良好，相关系数R均大于0.999。11种青霉素类抗生素标准曲线见图2。 表411种青霉素类抗生素药物的线性关系 序号 化合物 线性方程 相关系数R 准确度(%) 1 阿莫西林 Y=(8713.78)X+(1292.49) 0.9992 94.6~107.2 2 氨苄西林 Y=(22829.3)X+(4977.90) 0.9998 96.8~103.1 3 青霉素G Y=(7352.52)X+(-117.144) 0.9996 92.7~110.9 4 青霉素V Y=(3091.83)X+(-392.223) 0.9996 95.6~105.9 5 苯唑西林 Y=(8017.91)X+(-2505.56) 0.9997 94.1~108.3 6 氯唑西林 Y=(6853.66)X+(60.9161) 0.9996 89.9~110.9 7 萘夫西林 Y= (47564.7)X+(-829.499) 0.9996 95.6~104.6 8 双氯西林 Y=(3883.88)X+(-384.622) 0.9992 90.6~107.7 9 哌拉西林 Y=(15194.6)X+(-1554.21) 0.9993 96.1~104.7 10 阿洛西林 Y=(59687.1)X+(-9896.88) 0.9996 96.5-103.9 11 甲氧西林 Y=(34011.6)X+(-8198.74) 0.9997 95.3~106.0 Conc.(ug/L) Conc. (ug/L) 图2 11种青霉素类抗生素的校准曲线 2.3精密度考察 取20 ng/mL 的标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，平行测定6次，计算保留时间(RT)和峰面积(Area)两者的RSD%。结果显示各物质的保留时间(RT)的RSD 在 0.02%~0.04%之间，峰面积 (Area) 的RSD 在0.83%~4.41%之间，实验结果表明精密度满足实验需求。具体结果详见表5。 表5 精密度考察结果(n=6) 4.11 RSD% 10 6 2.74 3.26 4.41 7 1.20 2.4检出限和定量限 取 2 ng/mL的标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，根据信噪比，计算其检出限 (S/N=3)和定量限(S/N=10)。结果如表6显示，11种青霉素类化合物的检出限在 0.001~0.49 ug/kg范围之间。11种青霉素类化合物的定量限在0.003~1.64 ug/kg 范围之间。检出限、定量限符合 MRLs 和标准报批稿的要求。 表6 检出限和定量限 序号 物质名称 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) 序号 物质名称 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) 1 阿莫西林 0.49 1.64 7 双氯西林 0.02 0.06 2 氨苄西林 0.001 0.003 8 萘夫西林 0.012 0.04 3 青霉素G 0.01 0.03 9 哌拉西林 0.08 0.26 4 青霉素V 0.05 0.18 10 阿洛西林 0.00 0.01 5 苯唑西林 0.02 0.06 11 甲氧西林 0.02 0.07 6 氯唑西林 0.02 0.05 2.5样品测定结果 对市售南美白虾进行分析，未检出抗生素成分，并且在出峰区域无明显杂峰干扰，样品色谱图见图3；南美白虾质控样品(加标5ug/kg) 的 MRM 色谱图见图4。 图3 南美白虾样品的 MRM 色谱图 1.阿莫西林；2.氨苄西林；3.青霉素G；4.青霉素V；5.苯唑西林；6.氯唑西林；7.萘夫西林；8.双氯西林；9.哌拉西林；10.阿洛西林；11.甲氧西林。 图4 南美白虾质控样品(加标5ug/kg) 的 MRM 色谱图 结论 本实验使用岛津 LCMS-8045 液质联用系统，参照《水产品中青霉素类药物多残留的测定液相色谱-串联质谱法((报批稿)》，建立了南美白虾中11种青霉素类抗生素含量的检测方法。实验结果表明，11种青霉素类抗生素在 2~3000 ng/mL的范围内线性良好；精密度实验中，11种青霉素类抗生素保留时间的 RSD 分布在0.02%~0.04%之间，峰面积的RSD 分布在 0.83%~4.41%之间，仪器精密度良好；并且11种青霉素类抗生素物质的灵敏度 LOD 在 0.001~0.49 pg/kg 之间， LOQ在 0.003~1.64 ug/kg 之间，测试结果表明仪器灵敏度良好；符合 GB 31650-2019 关于青霉素类抗生素的 MRLs要求，同时也符合《水产品中青霉素类药物多残留的测定液相色谱-串联质谱法(报批稿)》的灵敏度 LOD=2 ug/kg， LOQ=5 ug/kg 的要求。 岛津应用云 本实验使用岛津LCMS-8045液质联用系统，参照《水产品中青霉素类药物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法（报批稿）》，建立了南美白虾中11种青霉素类抗生素含量的检测方法。实验结果表明，11种青霉素类抗生素在2~3000 ng/mL的范围内线性良好；精密度实验中，11种青霉素类抗生素保留时间的RSD分布在0.02%~0.04%之间，峰面积的RSD分布在0.83%~4.41%之间，仪器精密度良好；并且11种青霉素类抗生素物质的灵敏度LOD在0.001~0.49 μg/kg之间，LOQ在0.003~1.64 μg/kg之间，测试结果表明仪器灵敏度良好；符合GB 31650-2019关于青霉素类抗生素的MRLs要求，同时也符合《水产品中青霉素类药物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法（报批稿）》的灵敏度LOD=2 μg/kg，LOQ=5 μg/kg的要求。