粮谷中半胱氨酸、硒代蛋氨酸检测方案(ICP-MS)

SSL-CA20-739Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-177 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn HPLC-ICPMS测定粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量 ICPMS-177 摘要：参考《粮谷中硒代半半氨酸和硒代蛋氨酸的测定液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》标准，建立了 一种测定粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICPMS)。样品经过处理后，采用高效液相色 LC-20Ai 对硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸进行分离，电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030 系列检测进行定量分析。结果表明硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸与其他硒代氨基酸及亚硒酸盐和硒酸盐分离度良好，线性范围在0.1~10.0 ng/mL 范围内回归系数大于0.9999， 准确度98.83~100.58%，保留时间重现性 RSD% 低于0.57%，浓度重现性 RSD% 低于2.56%，回收率90.87%~99.40%，方法定量限分别为硒代半胱氨酸2.3 ug/kg， 硒蛋蛋氨酸 1.2 ug/kg， 低于标准定量限要求，适用于粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的含量分析。 硒是人体生命活动中必需的微量元素之一，近年来受到人们的广泛关注。它具有使人体抗衰老、预防癌变、保护与修复营养细胞、解毒排毒、提高免疫力等多种生理功能，被称为主宰生命的元素之一。硒对人体的重要性已十分明确，但权威资料表明硒的功能随其形态不同而异，只有有机形态的硒，如硒蛋白、硒代氨基酸、硒代多糖、硒多肽等，在有机体内才能转化为生理活性物质，被人体所吸收。 据调查，世界上有40多个国家和地区缺硒，我国也有72%的缺硒地区或低硒地区，其中1/3为严重缺硒地区，而缺硒是导致的克山病的重要因素。植物具有不同程度地吸收、利用和转化土壤环境中硒的能力， 是自然界硒生态循环中的重要环节。营养元素的形态分析越来越受到权威监管机构的重视。众所周知，微量元素的形态决定了其生理功能，因此单纯的总量分析已经无法满足分析需求。 参考《NY/T3556-2020粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定液相色谱-电感耦合等离子质谱法》标准，建立了一种测定粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICPMS)。样品经过处理后，采用高效液相色LC-20Ai 对硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸进行分离，电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030 系列检测进行定量分析。 1.1对照品 硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸根、硒酸根(MUCKLIN) 1.2样品 市售面粉 1.3仪器 本实验使用岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai 与电感耦合等离子体质谱仪 ICPMS-2030系列联用系统。具体配置为 LC-20Ai×2输液泵， DGU-20A3 在线脱气机， SIL-20AC 自动进样器， CTO-20AC木温箱，CBM-20A系统控制器， ICPMS-2030 系列电感耦合等离子体质谱仪， LabSolutions ICPMS Version 1.02工作站； AY-120 电子天平(日本岛津公司)；Vortex-5微型涡旋混合仪(中国其林贝尔公司)； Advantage A10 超纯水仪(瑞士Milli-Q公司)等。 1.4试剂 甲醇购自德国 Merk公司；实验用水由Milli-Q水净化系统经去离子与二次净化制得；蛋白酶购自MUCKLIN； HCI、三羟甲基氨基甲烷、乙酸铵、四丁基氢氧化铵、乙酸及其他试剂均为分析纯购自国药集团 方法 2.1对照品溶液配制 流动相配制以“S“Se”含量计浓度分别为0.10、0.50、1.0、2.0、5.0及10.0ng/mL 的混合标准溶液。 2.2Tris-HCI缓冲液配制 称取1.817g三羟甲基氨基甲烷溶于450mL水中，用 HCI调节 pH至7.5，加水稀释至500 mL。 2.3样品的处理方法 称取1g面粉于50mL离心管中，加入10 mL Tris-HCl缓冲液，室温下于超声水浴中超声 30 min。取出，加入25mg蛋白酶，混匀，置于(37±2)℃恒温振荡器中(转速300 r/min) 震荡酶解20h， 取出，于5000r/min 下离心10 min。吸取2mL上清液至10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，混匀，过 0.22 um进样分析。 2.4色谱条件 色谱条件参见表1 表1HPLC分析条件 参数 参数设定 色谱柱 InertSustain C18 4.6×250 mm， 5um 流动相 15 mmol/L乙酸铵， 0.2mmol/L四丁基氢氧化铵，5%甲醇， pH5.5 流速 1.2mL/min 柱温 30°℃ 进样量 20uL 洗针液 10%甲醇水溶液 洗脱程序 等度洗脱 2.5质谱条件 ICP-MS 仪器分析条件见表2。 表2ICP-MS分析条件 参数 参数设定 参数 参数设定 高频功率 1.20 kW 等离子体气流速 9.0 L/min 辅助气流速 1.10 L/min 载气流速 0.70 L/min 炬管类型 Mini 炬管 雾化器 同心雾化器 雾化室 旋流 雾化室温度 5C 采样深度 5.0mm 高频频率 27.12 MHz 碰撞气体 He 碰撞气流速 6 mL/min 池电压 -21 V 能量过滤器电压 7.0V 结果与讨论 3.1专属性考察 配制硒代半胱氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸根、硒酸根混合溶液，确认基线分离，实际样本中避免假阳性检出，见图1。 图1 典型色谱图 3.2线性关系考察 按“2.1对照品溶液的配置”项下规定进行标准曲线系列浓度的配制，记录各成分的峰面积，以浓度(浓度均以Se计)与峰面积做线性回归绘制标准曲线，结果见图2和图3所示。 图2 硒代半胱氨酸校准曲线 r=0.9999Conc.=0.6729*|+0.0052 图3 硒代蛋氨酸的校准曲线 r=0.9999Conc.=0.4166*1-0.0019 3.3准确度考察 配制高中低三水平浓度，对方法学准确度进行考察，结果以X±SD，见表3。 表3 准确度结果((n=6) 添加浓度(ng/mL) 准确度(%) 硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 0.20 99.33±0.004 99.08±0.005 2.0 98.83±0.048 100.58±0.030 8.0 99.44±0.034 99.98±0.063 3.4 精密度考察 配制高中低三水平浓度，对方法学浓度和保留时间精密度进行考察，结果以 RSD% 表示，见表4。 表4 浓度及保留时间精密度结果(n=6) 添加浓度(ng/mL) 浓度(%) 保留时间(%) 硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 0.20 2.15 2.56 0.47 0.20 2.0 2.48 1.49 0.33 0.19 8.0 0.43 0.78 0.57 0.25 3.5检出限考察 对浓度为0.10 ng/mL 对照品溶液考察硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的信噪比，折算信噪比 S/N=3时仪器检出限以及 S/N=10仪器定量限。 以如下既定公式进行计算： 其中Wlod/loq 方法检出限/方法定量限，单位为 ug/kg； Clod/loq 仪器检出限/仪器定量限，单位为 pg/L； 样液最终定容体积，单位为mL； m 试样溶液所代表试样的质量，单位为g； 计算结果依标准保留2位有效数字。 结果见表5： 图4基线考察 表5方法检出限考察结果 名称 方法检出限(ug/kg) 方法定量限 (ug/kg) 硒代半胱氨酸 0.68 2.3 硒代蛋氨酸 0.36 1.2 结果显示，本方法的检出限低于标准要求的 5.0 ug/kg 3.6实际样品分析 对市售面粉进行硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸检测，每份样品平行三次测试。以如下既定公式进行计算： 其中 W； 试样中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量，单位为 mg/kg； C 样液中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸浓度，单位为 ug/L； 空液中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨蛋浓度，单位为 ug/L； 白试V 样液最终定容体积，单位为mL； m 试样溶液所代表试样的质量，单位为g； 计算结果依标准保留2位有效数字。 待测物质浓度结果见表7。 图5 实际样品色谱图 表7 面粉测试结果(ug/kg) 样品名称 硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 样品1 N.D. 2.68 样品2 N.D. 1.42 样品3 N.D. 1.80 注：N.D.表示未检出 3.7回收率考察 对三份市售面粉，并对其进行0.50 ng/mL添加，按“2.3样品的处理方法”进行处理后进 HPLC-ICPMS分析，考察回收率。结果见表6： 表6 回收率考察结果 样品名称 回收率((%) 硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 样品1 94.87 99.40 样品2 90.87 98.67 样品3 95.00 97.53 结论 参考 《NY/T 3556-2020 粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定液相色谱-电感耦合等离子质谱法》标准，建立了一种测定粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICPMS)。样品经过处理后，采用高效液相色 LC-20Ai 对硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸进行分离，电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030系列检测进行定量分析。结果表明硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸与其他硒代氨基酸及亚硒酸盐和硒酸盐分离度良好，线性范围在0.1~10.0 ng/mL 范围内回归系数大于0.9999，准确度98.83~100.58%，保留时间重现性 RSD% 低于0.57%，浓度重现性RSD% 低于2.56%，回收率90.87%~99.40%，方法定量限分别为硒代半胱氨酸2.3 pg/kg， 硒代蛋氨酸 1.2 ug/kg，低于标准定量限要求，适用于粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的含量分析。 岛津应用云 参考《NY/T 3556-2020 粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定 液相色谱-电感耦合等离子质谱法》标准，建立了一种测定粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICPMS）。样品经过处理后，采用高效液相色LC-20Ai对硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸进行分离，电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030系列检测进行定量分析。结果表明硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸与其他硒代氨基酸及亚硒酸盐和硒酸盐分离度良好，线性范围在0.1~10.0 ng/mL范围内回归系数大于0.9999，准确度98.83~100.58%，保留时间重现性RSD%低于0.57%，浓度重现性RSD%低于2.56%，回收率90.87%~99.40%，方法定量限分别为硒代半胱氨酸2.3 μg/kg，硒代蛋氨酸1.2 μg/kg，低于标准定量限要求，适用于粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的含量分析。