鱼肉中孔雀石绿检测方案(样品前处理)

兽残篇www.biocomma.cn-—固相萃取产品应用手册(6版) indd 722021/1/2715：05：00 鱼肉中孔雀石绿检测的固相萃取方法(CopureALA/PRS) 《GB/T 20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相荧光检测法》 《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》 一、样品提取 准确称取鱼肉样品5.0 g于50mL离心管1中，加入1.5mL20%的盐酸羟胺，2.5 mL 1.0 mol/L的对甲苯磺酸，5.0mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液(4.95g无水乙酸钠及0.95 g对甲苯磺酸，用乙酸调pH=4.5，定容至1L)，匀浆机均质30 s(10000r/min)。加入10 mL乙腈，剧烈振摇30 s.加入5g酸性氧化铝，震荡30s。离心机离心10 min (3000 r/min)，取上清液转移至预先加好10 mL水、2mL二甘醇的离心管2中。加入10 mL乙腈至离心管1中，重复上述提取一次，合并乙腈层。离心管2中加入15 mL二氯甲烷，振荡10 s， 离心10 min(3000r/min)， 取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用5 mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。将提取液45℃旋转蒸发至1 mL，再用2.5mL乙腈溶解，待净化。 二、SPE 柱净化 (CopureALA， 1000mg/3mL； Copure°PRS， 500 mg/3mL) 活化：按照ALA 柱在上， PRS 柱在下顺序将两柱串联，固相萃取柱使用前使用5mL乙腈活化。 上样和洗脱：将梨形瓶中的待净化液转移至 ALA 柱中净化，梨形瓶使用5mL的乙腈分两次洗，弃去ALA柱， 吹 PRS 柱至近干，在不抽真空的情况下，加入5 mL 5%氨水乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液。 重新溶解：洗脱液45℃氮吹至近干，用1mL乙腈定容，过0.45 Hm滤膜，待上机测试。 三、仪器条件 设备： Waters Alliance 2695 色谱柱： XB-C18 (4.6 mm×250 mm， 5Hm) 检测器： Waters 2487 紫外检测器 检测波长：618 nm B： 0.05 mol/L 乙酸铵缓冲溶液 洗脱方式：梯度洗脱见表1 表1 梯度洗脱条件 时间/min A(%) B(%) 60.0 40.0 3.0 60.0 40.0 3.1 80.0 20.0 10.0 80.0 20.0 10.1 60.0 40.0 13.0 60.0 40.0 流速：1.2 mL/min 进样体积：50 四、实验结果 表2 0.1 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果 名称 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 2 3 孔雀石绿 93.7 88.5 90.7 90.9 2.3 分钟 图1添加水平为0.1 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿检测色谱图 一、样品提取 准确称取鱼肉样品 5.0 g 于 50 mL 离心管 1 中，加入 1.5 mL  20% 的盐酸羟胺，2.5 mL 1.0 mol/L 的对甲苯磺酸，5.0 mL 乙 酸钠 - 对甲苯磺酸缓冲液（4.95 g 无水乙酸钠及 0.95 g 对甲 苯磺酸，用乙酸调 pH=4.5，定容至 1 L），匀浆机均质 30 s（10000  r/min）。加入 10 mL 乙腈，剧烈振摇 30 s。加入 5 g 酸性氧 化铝，震荡 30 s。离心机离心 10 min（3000 r/min）, 取上清 液转移至预先加好 10 mL 水、2 mL 二甘醇的离心管 2 中。加 入 10 mL 乙腈至离心管 1 中，重复上述提取一次，合并乙腈层。 离心管 2中加入 15 mL二氯甲烷，振荡 10 s，离心 10 min（3000  r/min），取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用 5 mL 乙腈、10  mL 二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。 将提取液 45℃旋转蒸发至 1 mL，再用 2.5 mL乙腈溶解，待净化。 二、SPE 柱净化（Copure® ALA，1000 mg/3 mL；Copure®  PRS，500 mg/3 mL） 活化：按照 ALA 柱在上，PRS 柱在下顺序将两柱串联，固相萃取柱使用前使用 5 mL 乙腈活化。 上样和洗脱：将梨形瓶中的待净化液转移至 ALA 柱中净化， 梨形瓶使用 5 mL 的乙腈分两次洗，弃去 ALA 柱，吹 PRS 柱 至近干，在不抽真空的情况下，加入 5 mL　5% 氨水乙腈溶 液进行洗脱，收集洗脱液。 重新溶解：洗脱液 45℃氮吹至近干，用 1 mL 乙腈定容， 过 0.45 µm 滤膜，待上机测试。 三、仪器条件 设备：Waters Alliance 2695 色谱柱：XB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 µm) 检测器：Waters 2487 紫外检测器 检测波长：618 nm 流动相：A：乙腈   B：0.05 mol/L 乙酸铵缓冲溶液 洗脱方式：梯度洗脱 见表 1 表 1 梯度洗脱条件