水产品中孔雀石绿和结晶紫检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F001 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 水产品中孔雀石绿和结晶紫的测定解决方案 关键词 全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；孔雀石绿；结晶紫 介绍 孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由1摩尔分子的苯甲醛 (Benzaldehyde)和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱 (Leuco base)，在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱。它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。 本品针对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，现市面上还暂无针对水霉病能够短时间解决水霉病的特效药物，这也是为什么这个产品在水产业禁止这么多年还禁而不止，水产业养殖户挺而走险继续违规使用孔雀石绿的根本原因，其他方面，也可以很好的用于鳃霉病、小瓜虫病、车轮虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病，和其他一些细菌性疾病都有很好的效果。农业部以将孔雀石绿列为水产上的禁药，非食用鱼的观赏鱼还可以使用。 对于孔雀石绿的检测现有两个国标，分别是GB19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和GB20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法。其中GB19857-2005采用液质方法对四种孔雀石绿含量分别进行测定，加入内标进行内标矫正。GB20361-2006法中加入硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫的活双双键还原，分别形成隐形孔雀石绿和隐性的孔雀石绿，最后再以荧光检测二者的总量。孔雀石绿结构中的双键属于活泼的反应位点，常常容易发生氧化或者去甲基化，导致测试孔雀石绿比较困难。 图1.孔雀石绿和结晶紫的结构式及相互转化 本方法参考了上述方案的两种国标的前处理过程，采用不加入还原剂对样品进行前处理，加入内标物质后采用中性氧化铝固相萃取柱净化目标物，洗脱目标物后浓缩经液相色谱-质谱/质谱联用检测4种目标化合物。 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30 全自动均质器 Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Agilent 1260 高效液相色谱 (HPLC)， Agilent6410质谱检测器(MS) 中性氧化铝固相萃取柱 (RayCure AL-N，1：1g/3 甲醇(HPLC)；乙腈(HPLC)；水 5 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取0.385g 无水乙酸铵溶解于1000mL 水中，冰乙酸调pH到4.5；体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶容：量取5mL乙酸铵缓冲溶液(5mol/L)用甲醇定容至100 mL。 2.标准溶液的配制 将1.0 Hg/mL 的混合标准储备液和0.1Hg/mL的混合内标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep200 全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 Hg/L的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体积(mL 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 3.00 乙腈 2 直接稀释 A1 1000.00 1.50 A3 100.00 1.00 乙腈 乙腈 3 直接稀释 A3 100.00 1.00 A4 10.00 1.00 乙腈 乙腈 4 内标曲线 A4 10.00l 1.00 A11 0.50 1.00 乙腈 乙腈 5 内标曲线 A4 10.00l 1.00 A12| 1.00| 1.00 乙腈 乙腈 6 内标曲线 A1 100.00 1.00| A13| 2.00 1.00 乙腈 乙腈 7 内标曲线 A1 100.00| 1.00| A14 5.00 1.00 乙腈 乙腈 8 内标曲线 A1 100.00| 1.00 A15 10.00 1.00 乙 乙腈 3.样品前处理 3.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 固相萃取柱 中性氧化铝柱(RayCure，1g/3mL) 活化 乙腈 洗脱 乙腈 3.2提取 称取5.0g已捣碎的样品于50 mL 离心管中，加入200uL混合内内标准溶液(100 ppb)，加入11mL乙腈，用 AH-30 全自动均质器以10000 r/min 的速度匀浆提取30 s并洗涤刀头，4000 r/min 离心5min，上清液转移至25mL管管中；残渣加入乙腈后再提取一次，合并上清液至25 mL试管中，用乙睛定容至25.0 mL，摇匀备用。 3.3净化 移取5.0mL 上述的样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱，5mL乙腈洗涤样品瓶，收集全部流出液， 用 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪在40℃条件下浓缩至约1mL，用乙腈准确定容至1.0mL， 再加入1mL乙酸铵溶液(5 mmol/L)震荡混匀，经滤膜过滤后供液相色谱-质谱/质谱测定。具体的固相萃取方法(见图3)。 序号 命令 溶剂 排出 速(mL/min 时间(min) 1 清洗样品通道 Acetonitrile 10 5 2.8 2 活化 Acetonitrile 废液1 10 5 0.9 3 活化 Acetonitrile 废液1 10 5 0.9 4 上样 收集 2 25 14.1 5 清洗样品瓶 Acetonitrile 收集 40 5 3.5 6 气推 收集 ：10 5 1.1 7 结束 图 2.Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 图 3.Fotector Plus 固相萃取方法 4.检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5pm×21mm×50mm 流速 0.300 mL/min 流动相 A： H，0， B： Acetonitrile 柱温 35℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0 min 乙腈40%，0-1.0 min 乙腈80%， 1.0-4.0 min 乙腈80%，4.0 min-4.5 min乙腈40%，4.5-7.0 min 乙腈40%。 4.2 MRM 参数 表1.4种化合物串联质谱检测参数 CompoundName ISTD PrecursorIon Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell AcceleratorVoltage Polarity 隐性结晶紫 FALSE 374 358.2 40 160 33 7 Positive FALSE 374 253.1 40 160 37 7 Positive FALSE 374 238.1 40 160 29 7 Positive 结晶紫 FALSE 372 356.1 40 160 41 7 Positive FALSE 372 340.1 40 160 50 7 Positive D6-LMG TRUE 337.2 322.2 40 135 22 7 Positive D5-MG TRUE 334.2 318.2 40 135 40 7 Positive 隐性孔雀石绿 FALSE 331.2 316.2 40 135 22 7 Positive FALSE 331.2 239.2 40 135 35 7 Positive 孔雀石绿 FALSE 329.2 313.2 40 135 35 7 Positive FALSE 329.2 208.2 40 135 35 7 Positive 5.结果与结论 为了验证该方法的回收率，本实验向鲈鱼样品(5g)中加入上述4种化合物标准品(20pL，1mg/L)和2种弋代孔雀石绿和氘代隐性孔雀石绿(20 L，1 mg/L)作为内标进行加标回收验证(n=3)。数据如(表2所示)：四种目标化合物的加标回收率均在90-110%之间， RSD 值控制在6%以内。说明该方法能够很好地运用于水产品样品中孔雀石绿和结晶紫的检测。 表2.鲜活水产品的加标回收率及 RSD 值(40ng/kg) 化合物 (Compound) 回收率(%) 样品-1 Sample-1 回收率(%) 样品-2 Sample-2 回收率(%) 样品-3 Sample-3 平均回收率 Average Recoveries (%) RSD(%) 孔雀石绿 102.36 106.15 108.05 105.52 2.75 结晶紫 97.98 98.60 94.09 96.89 2.52 隐性孔雀石绿 106.43 98. 57 109.97 104.99 5.56 隐性结晶紫 107.64 103.46 109.87 106.99 3.04 6.解决方案的优势 睿科 AH-30 全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。， 一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 全自动均质器 全自动液体样品处理工作站 高通量真空平行浓缩仪 全自动固相萃取仪标曲配制 预浓缩 净化 全自动平行浓缩仪 均质 浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 @睿科集团股份有限公司 2020年5月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 对于孔雀石绿的检测现有两个国标，分别是GB19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和GB20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法。其中GB19857-2005采用液质方法对四种孔雀石绿含量分别进行测定，加入内标进行内标矫正。GB20361-2006法中加入硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫的活泼双键还原，分别形成隐形孔雀石绿和隐性的孔雀石绿，最后再以荧光检测二者的总量。孔雀石绿结构中的双键属于活泼的反应位点，常常容易发生氧化或者去甲基化，导致测试孔雀石绿比较困难。