水产品中4种孔雀石绿检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F005 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定水产品中4种孔雀石绿 孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由1摩尔分子的苯甲醛(Benzaldehyde)和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱(Leuco base)，在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱。 对于孔雀石绿的检测现有两个国标，分别是GB 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和 GB 20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法。其中 GB 19857-2005采用液质的方法对四种孔雀石绿含量分别进行测定，加入内标进行内标矫正。GB20361-2006 法中加入硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫的活泼双键还原，分别形成隐性孔雀石绿和隐性的结晶紫，最后再以荧光分别检测二者的含量。孔雀石绿结构中的双键属于活泼的反应位点，常常容易发生氧化或者去甲基化，导致测试孔雀石绿比较困难。 图-1.四种孔雀石绿的结构式及相互转化 洗脱目标产物后，加入纯净水稀释至指定刻度，液相-质谱/质谱联用检测4种目标化合物。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；孔雀石绿 2.仪器和耗材 全自动固相萃取仪 (Raykol FotectorPlus/Fotector-02HT， 48位，60位均可) 中性氧化铝固相萃取柱(1g/6 mL，自填)，MCX固相萃取柱 (Waters Oasis， 60 mg/3 mL) 高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410或相当 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 甲醇(优级级)；水；5 mmol/L乙酸胺缓冲溶 液：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于1000mL水中， 冰乙酸调pH到4.5； 0.1 mol/L乙酸 缓冲溶液：称取7.71g 无水乙酸胺溶解于1000mL水中，冰乙酸调 pH 到4.5； 5 mol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取38.5 g无水乙酸胺溶解于90 mL 水中，冰乙酸调pH至4.5；0.25 g/mL盐酸羟胺水溶液；1.0 mol/L 对甲苯磺酸溶液；体积分数为5%的乙酸胺甲醇溶液：量取5mL乙酸按缓冲溶液(5mol/L)用甲醇定容至100mL。 3.1鲜活水产品提取 称取 5.0 g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200 uL混合内标标准溶液(100 ppb)，加入11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min， 8000 r /min 匀浆提取 30 s， 4000 r/min 离心5 min， 上清液转移至25mL 比色管中；另取一50 mL 离心管加入11 mL 乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，旋涡混匀器上振荡30s， 超声波振荡 5 min， 4000 r/min 离心 5 min， 上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。 3.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 中性氧化铝固相萃取柱(1g/6mL，自填) 活化 乙腈 洗脱 乙腈溶液 3.3净化 移取5mL上述的样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱，5 mL乙腈洗涤样品瓶，收集全部流出液，30℃旋转蒸发至约1mL，加入1mL乙酸铵(5mmol/L)溶液定容，滤膜过滤后供液相色谱-质谱/质谱测定。具体的固相萃取方法见图-2。 序号 命令 溶剂 排出 流速mL/min 体积(mL) 时间[min) 1 清洗样品通道 C2H3N 40 8 2.1 2 活化 C2H3N 废液1 3 5 2.1 3 上样 收集 3 5 2.2 4 清洗样品瓶 C2H3N 收集 10 5 3 5 气推 收集 20 10 1.3 6 结束 图-2. Fotector Plus 孔雀石绿的固相萃取净化方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 4.2 MRM 参数 表-1.孔雀石绿类化合物串联质谱检测参数 Compound ISTD Precursor Product Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Voltage Polarity Name Ion Ion Energy FALSE 374 358.2 40 160 33 7 Positive 隐性结晶紫 FALSE 374 253.1 40 160 37 7 Positive FALSE 374 238.1 40 160 29 7 Positive 结晶紫 FALSE 372 356.1 40 160 41 7 Positive FALSE 372 340.1 40 160 50 7 Positive D6-LMG TRUE 337.2 322.2 40 135 22 7 Positive D5-MG TRUE 334.2 318.2 40 135 40 7 Positive 隐性孔雀石绿 FALSE 331.2 316.2 40 135 22 7 Positive FALSE 331.2 239.2 40 135 35 7 Positive 孔雀石绿 FALSE 329.2 313.2 40 135 35 7 Positive FALSE 329.2 208.2 40 135 35 7 Positive Ps：孔雀石绿和结晶紫采用 D5-MG内标，隐性结晶紫和隐性孔雀石绿采用 D5-LMG 内标。 4.3色谱图 下图为4种化合物的标准溶液(10ppb)在液质联用上的提取色谱图： 图-3.四种化合物的 MRM质谱图 5.方法验证 5.1样品加标实验 验证该方法的回收率，本实验向鲈鱼样品(5g)中加入上述4种孔雀石绿标准品(20pL，1mg/L)和2种种代孔雀石绿和隐性孔雀石绿(20pL， 1 mg/L) 作为内标进行加标回收验证(n=3)。数据如表-2所示：四种孔雀石绿的加标回收率均在 90-110%之间， RSD 值控制在6%以内。说明该方法能够很好地运用于水产品样品中4种孔雀石绿的检测。 表-2.动物肉制品中的加标回收率及 RSD 值(4 ug/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recoveries (%) 孔雀石绿 102.36 106.15 108.05 105.52 2.75 结晶紫 97.98 98.60 94.09 96.89 2.52 隐性孔雀石绿 106.43 98.57 109.97 104.99 5.56 隐性结晶紫 107.64 103.46 109.87 106.99 3.04 6.1孔雀石绿类样品容易在前处理过程中发生氧化还原反应，隐性和显性之间可能发生转化，因此需要在样品提取时加入内标物进行前处理实验跟踪。 6.2样品基质过于复杂，导致化合物在液相响应值较低，那么净化过程可以采用 MCX 柱进行净 7.仪器特征优势 本方法可实现水产品孔雀石绿净化过程自动化，与手动添加溶剂、手动添加样品以及手动添加洗脱液相比，通过 Fotector Plus 全自动固相萃取仪对其进行自动添加溶剂、自动添加样品以及自动洗脱，精准地移取体积以及精准地上样速度和精准地洗脱速度，保证孔雀石绿净化效果，也能确保净化 化，采用阳离子交换的固相萃取柱进行净化，但需注意将待净化液进行酸化后(pH=2.0-4.0) 进行固相萃取净化。也可考虑采用还原剂硼氢化钠将化合物转换为隐形的孔雀石绿和结晶紫，进行二者总量的测定。 任务能顺利完成；通过 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪对净化完后的洗脱液进行平行浓缩，样品架兼容性避免样品转移过程，减少样品的损失，仅仅只需 30min 左右，便可一次性可解决60个样品浓缩，两种仪器的配合应用轻松地解决实验室人员的烦恼，减轻实验室人员工作量。 ERoyK ERayKol 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪 样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 网址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 本方法参考了上述方案的两种国标的前处理过程，采用不加入还原剂对样品进行前处理，加入内标物质后采用中性氧化铝固相萃取净化目标物，洗脱目标产物后，加入纯净水稀释至指定刻度，液相-质谱/质谱联用检测4种目标化合物。