水产品中氯霉素类化合物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F005 解决方案 水产品中氯霉素类化合物的测定解决方案 高效液相色谱/串联质谱；全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；氯霉 氯霉素类药物是一类广谱性抗生素，作为药物常用于家禽疾病治疗和预防。由于氯霉素对人体有严重的毒副作用，目前美国、日本、韩国和欧盟等国家和地区均已禁止在食用性动物中使用氯霉素，并规定在动物源性食品中不得检出。本实验采用GB/T22338-2008中的方法，均质样品后采用全自动固相萃取仪实现自动化净化浓缩样品，大大提高效率。采用HPLC-MS/MS电喷雾(ESI-)，多反应监测(MRM)模式检测。氯霉素和氟甲砜霉素在添加浓度为0.1~5.0 Hg.Kg-1范围内，回收率分别为84.95~97.95%，72.57~91.7%之间；甲砜霉素在添加浓度为1.0~5.0Hg.Kg-1范围内，回收率在69.93~91.75%之间；相对标准偏差RSD(n=4)在4.2~12.3%之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。 1.仪器与试剂 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30 全自动均质器 Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 液相色谱-质谱联用仪 (Aglent1260+Agilent6410， ESI 负离子模式) 离心机(湘仪， H-2050R) 涡旋混合器(IKA@MS3 basic) 硅胶固相萃取小柱(RayCure Silica，500mg/3mL， RC-204-16843) 丙酮(色谱纯， sigma 公司)，正己烷(色谱纯，sigma 公司)，乙腈(色谱纯， sigma公司)，无水硫酸钠(AR.，国药)。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质 (sigma 公司) 2.样品前处理 2.1提取、浓缩 称取5.00g(±0.01)新鲜鱼肉试样，加入5g左右的无水硫酸钠；加入一定量氯霉素类混合标准物质工作液，加入20mL乙乙，用AH-30全自动均质器均质1min， 再用20mL 乙清清洗均质器刀头， 以5500 r/min 离心5 min， 转移上清液于分液漏斗中，加15mL乙腈饱和正己烷。残渣中再加入20 mL乙腈，振摇3 min，以5500 r/min 离心5 min， 取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5min， 静置分层，取下层乙腈层于浓缩瓶中，加入5 ml异丙醇，用MPE 高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干。加入5mL丙酮+正己烷(1：9)，振荡后转移到上样瓶中，过柱净化。 2.2净化 表1.固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 硅胶柱 (RayCure， 500mg/3mL) 淋洗 丙酮/正己烷混合溶液(1：9) 洗脱 丙酮/正己烷混合溶液(6：4) 硅胶固相萃取小柱用10 mL丙酮+正己烷(1+9)以10mL/min 的速度活化；5ml丙酮+正己烷(1+9)溶解上步提取液残留物以1 mL/min 上样；2mL丙酮+正己烷(1+9)淋洗，5mL丙酮+正己烷(6+4)溶液洗脱。洗脱液用 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪在40℃条件下浓缩至近干，用1mL 30%甲醇水定容。操作程序见下图1所示。 序号 命令 溶剂 排出 束(mL/min) 积 时间\min 1 清洗样品通道 丙酮正己烷(1：9) 3.2 2 活化 丙酮正己烷(1：9) 有机废液 10 10 2.3 3 上样 有机废液 1 5 5.6 4 清洗样品瓶 丙酮正己烷(1：9) 有机废液 60 3 4.2 5 淋洗 丙酮正己烷(1：9) 有机废液 2 2 1.5 6 清洗注射泵 丙酮正己烷(6：4) 30 3 0.5 7 洗脱 丙酮正己烷(6：4) 收集 1 5 5.4 8 气推 收集 1 2 2.4 9 结束 10 图1.Fotector Plus 氯霉素固相萃取净化方法 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5m×2.1 mm ×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： H，0 B： Methanol 柱温 30℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35psi 洗脱梯度 0-1.5 min， 5%流动相 B； 2-3.5 min， 70%流动相B；5.0-6.0 min， 5% 流动相B 3.1MMRM 参数 名称 分子量 MW 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 去簇电压 DP/V 碰撞气流量 CE/V 保留时间 /min 氯霉素 Chloramphenicol 323 321.1/257.1 321.1/152.0 120 5 6.03 321.1/ 52.1 120 10 氟甲砜霉素Florfenicol 358 356.1/184.9 356.1/184.9 135 4 3.34 356.1/85.1 135 12 甲砜霉素 Thiamphenicol 356 353.9/90.0 353.9/184.9 130 4 2.52 353.9/185.1 130 15 3.2标准样品色谱图 图2.三种氯霉素的色谱图(5 ng/L， 左-氯霉素，中-氟甲砜霉素，右-甲砜霉素) 4.方法可行性验证 4.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制一系列混标标准工作曲线。组分系列浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 Hg/kg 以各组分的质量浓度 (X， ug/L)对峰面积(Y)绘制标准工作曲线。如果基质标准曲线响应与标准曲线响应相似，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重 相等，拟合出工作曲线，要求R’>0.995；此曲线两周需要重新酒置一次。 4.2样品基质加标测试 在5g空白鱼肉样品中分别添加0.1、1.0、5.0Hg.kg 氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素混标。回收率及精密度(见表2)。从表中数据看出，3个加标浓度的回收率均在 79-95%之间，相对标准偏差小于10%，符合痕量残留检测的要求；而甲砜霉素在添加浓度0.1Hg.kg的条件下，由于杂质干扰比较大，仪器灵敏度不够高，造成未检出。 名称 添加浓度/lg.kg 鱼肉基质 回收率/% RSD (n=4)/% 氯霉素 0.1 88.30 5.6 1.0 87.18 8.3 5.0 88.34 6.2 氟甲砜霉素 0.1 91.70 7.8 1.0 82.57 5.9 5.0 85.54 6.5 甲砜霉素 0.1 \ \ 1.0 79.93 4.4 5.0 80.03 7.5 5.结果与结论 5.1氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮和乙腈等，文献报道多采用碱化乙酸乙酯提取，可以得到很好的回收率。本实验参考 GB/T 22338-2008方法，用乙腈提取食品中的氯霉素类药物。 5.2根据提取的方法不同，可选择多种净化小柱，大量文献报道多采用 HLB、C18与硅胶小柱联用，均取得比较理想的效果。由于 HLB 和 C18 固相萃取小柱价格比较贵，洗脱溶剂比较多的特点，本实验采用硅胶小柱净化提取液，方法简便快捷，成本低，且洗脱溶剂用量少。 6.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/EVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 全自动均质器均质 高通量真空平行浓缩仪预浓缩 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 @睿科集团股份有限公司 2020年5月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 氯霉素类药物是一类广谱性抗生素，作为药物常用于家禽疾病治疗和预防。由于氯霉素对人体有严重的毒副作用，目前美国、日本、韩国和欧盟等国家和地区均已禁止在食用性动物中使用氯霉素，并规定在动物源性食品中不得检出。本实验采用GB/T22338-2008中的方法，均质样品后采用全自动固相萃取仪实现自动化净化浓缩样品，大大提高效率。采用HPLC-MS/MS电喷雾（ESI-），多反应监测（MRM）模式检测。氯霉素和氟甲砜霉素在添加浓度为0.1～5.0 µg.Kg-1范围内，回收率分别为84.95～97.95%，72.57～91.7%之间；甲砜霉素在添加浓度为1.0～5.0µg.Kg-1范围内，回收率在69.93～91.75%之间；相对标准偏差RSD（n=4）在4.2～12.3%之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。