牛奶中喹诺酮类化合物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RKFT-F005 解决方案 牛奶中喹诺酮类化合物的检测 全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；沙星类化合物 介绍 喹诺酮类 (Quinones， QNs)抗生素是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于预防和治疗动物疾病。由于喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织、蛋或奶等动物源性食品后喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，造成人体疾病对该药物的严重耐药性，影响身体健康。 本方案参考《GB/T 21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》，采用EDTA缓冲液对目标化合物进行提取，提取液用HLB柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪进行净化，高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，整个检测结果具有良好的平行性与准确性。 1.仪器与耗材 仪器和耗材 睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410 HLB 固相萃取柱 (RayCure， 200mg/6mL，货号： RC-204-36476) 甲醇(色谱纯)，水 Na2EDTA(0.1mol/L)-MCIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH4.0)：准确称取60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0g于烧杯中，加入1000 mL 超纯水，加入浓盐酸调节 pH 值至4.0 2.样品制备及前处理 2.1提取 准确称牛奶5.0g于50mL 离心管中，加入40mL 0.1mol/L的 EDTA-MCIlvaine 缓冲液溶解，涡旋混合1.0min，超声提取10min， 于高速冷冻离心机上以10000rpm 的转速离心10min(温度为4℃)。取上清液于80mL玻璃上样管中，备用。 2.2 固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 HLB柱(RayCure， 200mg/6mL) 活化 甲醇，水 淋洗 5%甲醇水溶液 洗脱 甲醇 2.3固相萃取净化 分别以 6mL 甲醇和6mL水活化 HLB柱，将上述样样溶液以 3mL/min 的速度进行上样，用3mL 5%的甲醇水溶液淋洗柱子，然后用气推的方式推干柱子。最后以6mL 甲醇洗脱目标化合物(具体方法设置见图1)。将洗脱液在睿科 EVA 80 云自动平行浓缩仪上浓缩至近干，加入 1mL 0.2%甲酸水溶液定容，涡旋混匀，过滤膜上机检测。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间min 1 清洗样品通道 CH30H 1.5 2 活化 CH30H 有机废液 3 6 2.5 3 活化 H20 废水 3 6 2.5 4 上样 废水 3 45 17.6 5 淋洗 5%甲醇水 有机废液 3 3 1.4 6 气推 有机废液 80 40 2.8 7 清洗注射泵 CH30H 40 5 0.6 8 洗脱 CH30H 收集 1 6 6.5 9 气推 收集 2 2 1.4 10 气推 收集 20 10 1.3 11 结束 图-1 Fotector plus 固相萃取净化方法 3.检测条件 3.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx21 mmx50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetic(0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 35°C 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI+ 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-1.0 min， 90%流动相A； 1.0-4.0 min， 50%的流动相A；4.01-6.0 min， 50%流动相A 保持2 min； 6.01-7.0 min，90%的流动相 A，7.01-10.0 min，90%的流动相A 保持 3 min. 3.2 MRM 参数 表-2.14种沙星类抗生素串联质谱检测参数 Compound Precursor Product Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Name Ion ion Energy Voltage 依诺沙星 321.2 303.2 20 125 20 7 232.1 20 125 36 7 诺氟沙星 320.2 302.2 20 130 18 7 233.1 20 130 22 7 氧氟沙星 362.2 318.2 20 140 16 7 261.1 20 140 26 7 培氟沙星 334.2 316.2 20 145 18 7 290.3 20 145 14 7 环丙沙星 332.2 314.2 20 125 18 7 231.1 20 125 40 7 洛美沙星 352.3 308.2 20 120 14 7 265.1 20 120 22 7 丹诺沙星 358.2 340.2 20 135 20 7 255.1 20 135 42 7 恩诺沙星 360.2 342.2 20 135 20 7 316.2 20 135 16 7 沙拉沙星 386.2 342.2 20 125 18 7 299.2 20 125 30 7 西诺沙星 263.1 244.1 20 135 18 7 188.8 20 135 30 7 吡哌酸 304.1 271.1 20 150 18 7 189.0 20 150 26 7 氟甲喹 262.1 262.1 20 105 13 7 244.1 20 105 33 7 噁喹酸 262.1 155.9 20 100 13 7 244.1 20 100 29 7 萘啶酸 233.2 233 20 90 9 7 215.1 20 90 25 7 4.样品测试 4.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需要用空白样品加入一系列浓度标准品，按照上述提取和净化步骤，制备基质加标曲线。 4.2 样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向牛奶样品(5g)中分别加入上述14种喹诺酮类标准品(20L，1mg/L， n=4)进行加标回收验证。测试结果如表-2所示，14种喹诺酮回收率在75%-105%之间， RSD 值小于 12%。说明该方法能够很好地运用于牛奶样品中14种沙星类抗生素的检测。 表-3.牛奶样品加标回收率及 RSD 值(20ug/kg) 化合物(Compound) 回收率(%) 样品-1 Sample-1 回收率(%) 样品-2 Sample-2 回收率(%) 样品-3 Sample-3 回收率(%) 样品-4 Sample-4 平均回收率Average Recoveries(%) RSD(%) 伊诺沙星 79.2 83.9 87.6 93.1 85.9 6.8 西诺沙星 81.9 82.9 86.8 92.5 86.0 5.6 诺氟沙星 95.9 83.8 104.1 93.9 94.4 8.8 氧氟沙星 83.8 83.7 90.6 88.3 86.6 4.0 培氟沙星 96.3 88.6 99.1 95.3 94.8 4.7 环丙沙星 86.1 80.5 95.0 90.5 88.0 7.1 洛美沙星 74.2 81.7 78.0 95.4 82.3 11.2 丹诺沙星 84.6 79.4 89.0 85.0 84.5 4.7 恩诺沙星 79.9 82.3 86.5 84.1 83.2 3.4 沙拉沙星 82.4 89.9 104.7 97.3 93.6 10.2 吡哌酸 88.2 80.2 86.4 81.7 84.1 4.5 氟甲喹 79.8 88.5 75.9 87.2 82.8 7.3 噁喹酸 78.8 88.5 79.9 87.2 83.6 5.9 萘啶酸 92.3 87.6 82.6 91.3 88.4 4.9 5.结果与讨论 牛奶样品蛋白质含量较高，离心时建议尽量采用高速冷冻离心的方式，沉降蛋白效果更好。 洗脱液氮吹应至近干或全干，沙星类化合物的回收率差别不大。但吹干时间如果过长，样品浓缩干燥后待测化合物可能以固态颗粒的形式随着氮吹气流飞走而损失。 6.总结 睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时 Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 睿科EVA 80 全自动平行浓缩仪通过独特的针自动追随液面技术可以极大地减少氮气使用量，同时避免手动氮吹需要经常去调节氮吹针高度带来的麻烦。 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.，Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2021年10月版 热线：箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com GB/T 21312-2007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法标准规定了动物源性食品中14种喹诺酮药物残留量检测的制样方法和高效液相色谱-质谱/质谱检测方法。标准适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋等动物源性食品中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、吡哌酸、奥索利酸、氟甲喹、西诺沙星、单诺沙星14种喹诺酮类兽药残留量的液相色谱-质谱/质谱法测定和确证。